JoVE Encyclopedia of Experiments
İmmünoloji
0 görüntüleme • 3:02 dk • July 8th, 2025
Lipopolisakkarit ile astarlanmış makrofajlar içeren bir tahlil plakası alın.
Hazırlama, aktif olmayan proinflamatuar sitokin öncülerinin ve NLRP3 proteinlerinin ekspresyonunu arttırır.
İyon akışını teşvik eden bir potasyum iyonoforu olan nigerisin ekleyin. Bu, hücre içi potasyum seviyelerini bozarak NLRP3 proteinlerini tetikleyerek büyük bir kompleks oluşturur.
Oligomerize NLRP3, adaptör proteinleri olan ASC'yi işe alır ve polimerizasyonlarına neden olur. ASC filamentleri, bir multiprotein kompleksi olan NLRP3-inflamatuar oluşturan pro-kaspaz-1'i işe alır.
Pro-kaspaz-1, yakınlık kaynaklı otomatik aktivasyona uğrar ve kaspaz-1 oluşturur. Kaspaz-1, proinflamatuar sitokin ve gasdermin-D proteinini parçalayarak bir plazma zarı gözeneği oluşturur.
Bu, sitokin sekresyonu ve inflamatuar programlanmış hücre ölümü, piroptoz, laktat dehidrojenaz veya LDH dahil olmak üzere hücre içi içeriklerin serbest bırakılması ile sonuçlanır. LDH içeren süpernatanı toplayın.
Substrat karışımı ekleyin - laktat, iyodonitrotetrazolyum menekşe veya INT boyası, NAD + ve terletaz. LDH, NAD + 'yı indirgeerken laktatı piruvata oksitler. Diaphorase, kırmızı renkli formazan oluşturarak INT'nin azalmasını katalize eder.
Renk yoğunluğu LDH salınımına karşılık gelir ve yüksek seviyeler piroptozla ilişkili hücre hasarının ve ölümünün arttığını gösterir.
Bir LDH salınım testi yapmak için, her deney kuyucuğuna 10 mikromolar nigerisin ile takviye edilmiş 50 mikrolitre DMEM-5 ortamı ve spontan ve% 100 lizis kontrol kuyularına 50 mikrolitre DMEM-5 ekleyin. 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte 60 dakika boyunca. 30 dakika sonra% 100 lizis kontrol kuyucuklarına 10 mikrolitre 10x lizis tamponu ekleyin ve diğer kuyucuklara 10 mikrolitre orta ekleyin. Kuluçka sonunda plakayı santrifüjleyin ve her bir oyuktan 50 mikrolitre süpernatanı şeffaf bir düz tabanlı plakaya aktarın.
Daha sonra, karanlıkta 30 dakikalık bir inkübasyon için her bir oyuğa 50 mikrolitre taze çözülmüş ve hazırlanmış substrat ekleyin, sinyalin plaka okuyucunun algılama sınırını aşmayacağını doğrulamak için 15 dakika sonra plakayı kontrol edin. İnkübasyonun sonunda, her bir oyuğa 50 mikrolitre durdurma çözeltisi ekleyin ve oyuk başına hücre lizis yüzdesinin hesaplanmasına izin vermek için OD490'ı uygun bir plaka okuyucuda ölçün.