Önceden Etiketlenmiş Nötrofillerde Nötrofil Hücre Dışı Tuzakların İndüksiyonu ve Görselleştirilmesi

Floresan etiketli nötrofiller içeren çok kuyulu bir plaka ile başlayın ve bunları anti-nötrofil sitoplazmik antikorlar içeren hasta serumu ile tedavi edin.

Bu antikorlar, nötrofilin Fc reseptörleri ile etkileşime girerek bir sinyal yolunu aktive eder, reaktif oksijen türleri veya ROS üretir ve peptidil arginin deiminazazı aktive eder.

ROS, nötrofillerin degranülasyonuna neden olur, enzimleri - elastaz ve miyeloperoksidaz sitoplazmaya salır. Bu enzimler ve aktive edilmiş peptidil arginin deiminazlar çekirdeğe translokasyon yapar.

Elastaz, histon-H1'i parçalar ve miyeloperoksidaz, kromatin dekondensasyonunu başlatarak histonları değiştirir. Aktive edilmiş peptidil arginin deiminaz, histon sitrülinasyonunu indükleyerek arginin kalıntılarını sitrüline dönüştürür ve daha fazla dekondensasyona katkıda bulunur.

Yoğunlaştırılmış kromatin, antimikrobiyal ve sitoplazmik proteinler dahil olmak üzere hücre içi proteinlerle karışır. Daha sonra, nötrofilin zarı parçalanır, sitoplazmik proteinlerle karıştırılmış yoğunlaşmamış kromatini hücre dışı boşluğa salır ve bir nötrofil hücre dışı tuzağı (NET) oluşturur.

NET'lerde yalnızca hücre dışı DNA'ya bağlanan hücre geçirimsiz bir DNA boyası ekleyin. Floresan mikroskobu altında, nötrofiller yeşil hücre dışı ağ benzeri yapılarla kırmızı görünür ve NET oluşumunu doğrular.

% 2 FCS içeren fenol kırmızısı içermeyen RPMI-1640 ortamında mililitre başına 420.000 hücre yoğunluğunda bir hücre süspansiyonu yapın. Siyah 96 oyuklu düz tabanlı bir plakanın her bir oyuğuna 90 mikrolitrede 37.500 nötrofil ekleyin.

Daha sonra, her bir oyukta% 10'luk bir konsantrasyona ulaşmak için seçilen uyaranın 10 mikrolitresini üç nüsha halinde ekleyin. Her zaman üç nüsha halinde negatif bir kontrol ekleyin. Karanlıkta 37 santigrat derecede 30 dakika ila 2, 4 veya 6 saat arasında değişen istenen süre boyunca inkübe edin. Daha sonra, her bir oyukta 1 mikromolar nihai konsantrasyona ulaşmak için 25 mikrolitre 5 mikromolar geçirimsiz DNA boyası eklemek için gereken geçirimsiz DNA boyası hacmini hazırlayın.

İnkübasyon süresinin bitiminden 15 dakika önce, her bir oyuğa 25 mikrolitre 5 mikromolar geçirimsiz DNA boyası ekleyin. Karanlıkta 37 santigrat derecede son 15 dakika boyunca inkübasyona devam edin. Bundan sonra, süpernatanı çok dikkatli bir şekilde çıkarın ve gerekirse saklayın. 100 mikrolitre% 4 paraformaldehit ekleyin. Plakayı karanlıkta tutun ve hemen bir sonraki bölüme geçin.

Ayarları yapılandırdıktan sonra Z Serisi'ni seçin. Adım sayısı olarak 10'u seçin . Adım Boyutu olarak 3 mikrometreyi seçin. Plakayı immünofloresan konfokal mikroskobu içine yükleyin.

Çalıştır sekmesine tıklayın. Plaka adını ve açıklamasını doldurun ve saklama yerini seçin. Edinilmesi gereken kuyuları seçin. Texas Red ve FitC için Maruz Kalma Süresini seçin, ardından Plaka Al'a tıklayın ve plaka başına yaklaşık 1 saat sürecek olan alımı başlatın.

Bundan sonra, Analiz Makrosu'nu seçin. Ardından W1'i seçin ve eşik değerini seçin. Ardından, istediğiniz piksel değerini seçin ve son olarak, ikinci bir ImageJ penceresinde W2'yi seçin ve istenen piksel değeriyle eşik değerini seçin. E-tablo dosyası için bir hedef seçin. Analizi çalıştırın ve daha sonra günlük dosyasını kaydedin.