İnsan Kanından Elde Edilen Nötrofillerden Lipitlerin Bifazik Ayırma ile İzolasyonu

Serbest bırakılan hücre içi bileşenlere sahip nötrofil homojenat içeren bir cam tüp alın.

Lipid-lipid ve lipid-protein etkileşimlerini bozan polar bir çözücü olan metanol ekleyin. Metanolün doğal polaritesi, polar lipitleri eşit olarak dağıtır ve onları çözündürür. Daha sonra, polar olmayan lipitlerle etkileşime girerek dağılmalarına ve çözünmelerine neden olan polar olmayan bir organik çözücü olan kloroform ekleyin.

Protein içeren peleti süpernatan içeren lipitlerden, polisakkaritlerden ve hücre kalıntılarından ayırmak için santrifüjleyin. Süpernatanı taze bir cam tüpe aktarın. Kloroform ve damıtılmış su ekleyin. Numuneyi santrifüjleyin.

Su ilavesi kendiliğinden bifazik bir sistem oluşturur ve biyomolekülleri alt kloroform ve üst su-metanol katmanları içinde böler.

Kloroform tabakası çözünmüş polar olmayan lipitleri içerirken, üst tabaka lipid olmayan kirleticiler ve daha fazla polar lipit içerir. Lipid içeren tabakayı bozmadan üst su-metanol tabakasını çıkarın.

Çözücüyü lipitlerden çıkarmak için bir vakum yoğunlaştırıcı kullanın. Daha fazla kullanana kadar daha düşük sıcaklıklarda saklayın.

Lipitleri insan periferik kanından türetilen nötrofillerden izole etmek için hazırlanan nötrofilleri alın ve buzun üzerine yerleştirin. Nötrofilleri PTFE contalı 15 mililitrelik vidalı kapaklı bir cam tüpe pipetleyin ve bir dakika çalkalayarak homojen hale getirin. Daha sonra 2 mililitre metanol ekleyin, ardından bir dakika sonra 1 mililitre kloroform ekleyin. Bir dakika daha çalkaladıktan sonra, cam tüpleri oda sıcaklığında ve 50 RPM'de 30 dakika döndürün.

Daha sonra, çözeltiyi 7 santigrat derecede ve 1952 kez g'de 10 dakika santrifüjleyerek protein fraksiyonunu peletleyin. Süpernatanı, protein içeren peleti geride bırakarak 15 mililitrelik yeni bir cam vidalı kapaklı tüpe dikkatlice boşaltın. Gelecekteki miktar tayini için peleti eksi 20 santigrat derecede saklayın.

1 mililitre kloroform ekleyin ve bir dakika bekleyin. Ardından, 1 mililitre çift damıtılmış su ekleyin ve cam vidalı kapaklı tüpü numune ile 30 saniye boyunca ters çevirin. Numuneyi daha önce olduğu gibi santrifüjledikten sonra, üst fazı bulanık tabakaya kadar ancak bulanık tabaka dahil olmamak üzere çıkarın ve atın. Numuneleri bir vakum yoğunlaştırıcıda 60 santigrat derecede kurutun ve gerekene kadar eksi 20 santigrat derecede saklayın.