Makrofajlarda Cryptococcus neoformans Enfeksiyonunu Tespit Etmek için Bir Laktat Dehidrojenaz Serbest Bırakma Testi

Makrofajlar içeren çok kuyulu bir plaka alın.

Test kuyularına Cryptococcus neoformans ekleyin, kontrol kuyuları ise sadece makrofajlar içerir.

Makrofajlar, fagozomlar içindeki fagositoz mantarları.

Fagosite edilmemiş mantarları çıkarmak için tamponla yıkayın. Antibiyotik içermeyen ortam ekleyin. Kuluçkaya yatmak.

Fagozom lizozomla birleşerek bir fagolizozom oluşturur. Mantarlar fagolizozom pH'ını modüle eder ve sert fagolizozomal koşullarda hayatta kalmak için içsel mekanizmalara sahiptir. Mantarlar fagolizozomal membrana nüfuz eder ve polisakkarit dolu veziküllerin sitozolik birikimi ile birlikte çoğalır.

Hücre içi mantar kalışları ve replikasyonu, hücre ölüm yollarını tetikleyerek hücresel hasara neden olur. Bu, makrofaj lizizine ve laktat dehidrojenaz veya LDH dahil olmak üzere hücre içi içeriğin ortama salınmasına neden olur.

LDH içeren ortamları farklı zaman noktalarında toplayın. Maksimum hücresel LDH salınımı için kontrol makrofajlarını benzer zaman noktalarında parçalayın. Tahlil karışımını toplanan ortama ve lizatlara ekleyin. LDH, laktatı piruvata dönüştürerek NAD ⁺ 'yı azaltır. Diaphorase, tetrazolium tuzunu azaltarak kırmızı bir formazan ürünü oluşturur.

Bir plaka okuyucu kullanarak, Cryptococcus neoformans enfeksiyonunu takiben makrofaj lizizini ölçmek için formazan absorbansını ölçün.

Mantar hücrelerini bir makrofaj enfeksiyonu için hazırlamak için, C. neoformans hücrelerini bir orta log faz kültüründen toplayın ve santrifüjleyin, ardından aynı santrifüj koşulları altında 1 mililitre oda sıcaklığında PBS ile üç nazik yıkama yapın.

Son yıkamadan sonra, mantar hücrelerini mililitre başına 1.2 kez 10 ila sekizinci hücrelerde, antibiyotik içermeyen hücre kültürü ortam konsantrasyonunda yeniden askıya alın ve %70 ila %80 birleşik 6 oyuklu makrofaj kültür plakasının 4 oyuğunun her birine 1 mililitre mantar hücresi süspansiyonu ekleyin. Ardından, plakayı üç saat boyunca hücre kültürü inkübatörüne yerleştirin. Her bir oyuğun, yıkama başına kuyu başına 1 mililitre PBS ile üç kez nazikçe yıkanmasına izin vermek için plakayı dikkatlice eğin.

Son yıkamadan sonra enfeksiyon yeterliliğini ölçmek için, 6 oyuklu plakanın her bir oyuğuna 1 mililitre antibiyotik içermeyen ortam ekleyin ve plakayı hücre kültürü inkübatörüne yerleştirin. Uygun deneysel zaman noktalarında, her bir kuyucuktan süpernatanı toplayın ve standart protokollere göre her bir kuyucuktaki LDH miktarını ölçün. Aynı zaman noktalarında, maksimum sitotoksisite değerini belirlemek için enfekte olmamış makrofaj hücrelerini parçalayın.

Sitotoksisite daha sonra belirtildiği gibi formül kullanılarak hesaplanabilir.