$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Geçirgen bir zar eki ile ayrılmış iki odacıklı bir enfeksiyon sistemi alın. Alt bölme, yapışık insan keratinositleri veya deri hücreleri içerir.
Üst hazneye bakteriyel patojenler ekleyin ve inkübe edin. Membran, patojenlerin keratinositlerle doğrudan temasını önler. Patojenler, hücrelere ulaşmak için zarı geçen küçük bir toksin olan streptolizin S veya SLS salgılar.
Keratinositler üzerindeki sodyum bikarbonat yardımcı taşıyıcısı, hücre içi pH'ı koruyarak bikarbonat ve sodyum iyonlarının akışına aracılık eder. SLS, yardımcı taşıyıcıya bağlanır ve iyon taşınmasını bozarak hücre içi ozmotik strese yol açar.
Stresin neden olduğu aşağı akış sinyali, tecrit edilmiş Nükleer Faktör-Kappa B'ye veya NF-κB'ye bağlı inhibitörün bozulmasına neden olarak aktivasyonuna yol açar. Aktive edilmiş NF-κB çekirdeğe yer değiştirir ve proinflamatuar sitokin üretiminin yukarı regülasyonuna yol açar.
Hücre dışı sekresyon üzerine, sitokinler konak hücre üzerindeki ölüm reseptörlerine bağlanarak nekrozu başlatır. Kuluçka sonrası, bakteri toksininin etkisini değerlendirmek için kültür süpernatantını hasat edin.
Tedaviden hemen önce, hücreleri yıkamak için 1X PBS kullanın. Daha sonra, altı oyuklu plakalara farmakolojik tedavi olsun veya olmasın 2 mililitre taze büyüme ortamı veya 24 oyuklu plakaların kuyucuklarına 0,5 mililitre orta uygulayın. Daha sonra, bir laminer akış başlığı altında, her bir oyuğa steril bir 0.4 mikron geçirgen membran ekini dikkatlice yerleştirmek için steril forseps kullanın.
Enfeksiyon hazırlığı sırasında geçirgen eklerin nazik ve steril bir şekilde kullanılması, bu işlem sırasında membranın tehlikeye girmesini veya kontamine olmasını önlemek için kritik öneme sahiptir.
Üreticinin talimatlarına göre her bir oyuğun üst odasına taze hücre kültürü ortamı uygulayın. Daha sonra, geçirgen membran yerleştirme sisteminin üst odasına uygun bir hacimde normalleştirilmiş bakteri kültürü uygulayın ve kontrol kuyularına bakteri ortamı uygulayın.
Bakterilerin üst odaya dikkatli bir şekilde eklenmesi ve enfekte olmuş hücrelerin inkübatöre nazikçe taşınması kritik öneme sahiptir, çünkü deney düzeneği sırasında bakterilerin alt odayı kontamine etmemesi esastır.
Salgılanan konak proteinlerini değerlendirmek için, geçirgen membran ekini dikkatlice çıkarmak için steril forseps kullanın. Daha sonra, hücrelerin tek tabakasını rahatsız etmeden, ortamı alt odadan 1.5 mililitrelik tüplere toplayın.
Numuneleri 14.000 RCF ve 4 santigrat derecede 10 dakika boyunca santrifüjleyin ve hücresel kalıntıları topaklayın. Ardından, süpernatantın 50 mikrolitresi hariç hepsini çıkarın, 1.5 mililitrelik yeni bir tüpe aktarın ve eksi 20 santigrat derecede saklayın veya hemen kullanın.