Geçirgen Bir Membran Sisteminde Kültürlenmiş Enfekte Konak Hücrelerden Konak Hücre Lizatının Ekstraksiyonu

Geçirgen bir zar sisteminin alt bölmesinde memeli konakçı hücreleri tohumlayarak başlayın.

Streptokok - streptolizin S veya SLS toksini salgıladığı bilinen patojenik bir bakteri olan Streptococcus'u zar ekine ekleyin. SLS toksini membran gözeneğinden yayılır ve konak hücreye ulaşır.

Membrana bağlı sodyum-bikarbonat kotransporterleri, hücresel homeostazı koruyarak iyon taşınmasını düzenler. Toksin bu ortak taşıyıcılara bağlanarak iyon taşınmasını bozar ve konakçı hücrelerde ozmotik strese neden olur.

Bu, mitojenle aktive olan bir protein kinaz yolu olan p38 MAPK dahil olmak üzere birkaç aşağı akış sinyal kaskadını aktive eder. Aktive edilmiş p38 MAPK aşağı akış hedeflerini fosforile ederek bakterilere karşı hücresel bir tepki başlatır.

Ardından, geçirgen membran ekini çıkarın. Ortamı konakçı hücrelerin üzerine aspire edin. Hücresel içeriği serbest bırakmak için lizis tamponu ekleyin. Hücre kalıntılarını peletlemek için santrifüjleyin.

Çözünür lizat bileşenleri içeren süpernatanı ve çözünmeyen lizat bileşenleri içeren peleti toplayın. Daha fazla analiz için numuneleri saklayın.

Tedaviden hemen önce, hücreleri yıkamak için 1X PBS kullanın. Daha sonra, altı oyuklu plakalara farmakolojik tedavi olsun veya olmasın 2 mililitre taze büyüme ortamı veya 24 oyuklu plakaların kuyucuklarına 0,5 mililitre orta uygulayın. Daha sonra, laminer bir akış başlığı altında, her bir oyuğa steril bir 0,4 mikron geçirgen membran ekini dikkatlice yerleştirmek için steril forseps kullanın.

Enfeksiyon hazırlığı sırasında geçirgen eklerin nazik ve steril bir şekilde kullanılması, bu işlem sırasında membranın tehlikeye girmesini veya kontamine olmasını önlemek için kritik öneme sahiptir.

Üreticinin talimatlarına göre her bir oyuğun üst odasına taze hücre kültürü ortamı uygulayın. Daha sonra, geçirgen membran ekleme sisteminin üst bölmesine uygun bir hacimde normalleştirilmiş bakteri kültürü uygulayın ve kontrol kuyularına bakteri ortamı uygulayın.

Bakterilerin üst odaya dikkatli bir şekilde eklenmesi ve enfekte olmuş hücrelerin inkübatöre nazikçe taşınması kritik öneme sahiptir, çünkü deney düzeneği sırasında bakterilerin alt odayı kontamine etmemesi esastır.

Geçirgen membran ekini dikkatlice çıkarmak için steril forseps kullanın.

Konak hücre lizatlarının değerlendirilmesi için, konakçı hücreleri rahatsız etmeden ortamı tek tabakanın üzerine nazikçe aspire edin. Ardından, hücreleri bir kez durulamak için PBS kullanın. PBS'yi nazikçe aspire edin ve örneğin mililitre başına 0.5 ila 1.5 miligramlık bir protein konsantrasyonu elde etmek için hemen bir miktar buz gibi soğuk lizis tamponu uygulayın. Ardından, numuneleri 15 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin.

Daha sonra, hücreleri her bir oyuğun plaka yüzeyinden ayırmak için bir hücre kazıyıcı kullanın ve her bir oluğun tüm içeriğini 1,5 mililitrelik bir tüpe aktarın. Ardından, numuneleri 14.000 RCF ve 4 santigrat derecede 20 dakika santrifüjleyin.

Çözünür lizat bileşenlerini değerlendirmek için, süpernatanı yeni bir tüpe aktarın ve eksi 20 santigrat derecede saklayın veya hemen kullanın. Nükleer veya diğer çözünmeyen lizat bileşenlerini değerlendirmek için peleti ayırın ve eksi 20 santigrat derecede saklayın veya hemen kullanın.