JoVE Deneyler Ansiklopedisi
İmmünoloji
0 görüntülenme • 3:43 dk. • July 8th, 2025
Hücre içi kalsiyumun floresan indikatörü ile yüklenmiş bir insan epitel hücresi kültürü içeren bir görüntüleme odası alın.
Kalsiyum iyonları içeren bir büyüme ortamı ekleyin. Patojenik bir bakteri olan Shigella'yı tanıtın ve kuluçkaya yatırın.
Bakteri salgı sistemi konak hücreye nüfuz eder ve istila efektörlerini serbest bırakır. İstila, aktinin yeniden düzenlenmesini tetikleyerek bakterilerin etrafında zar fırlaması oluşturur.
İnvazyon bölgesinde, plazma zarı üzerindeki fosfolipaz C veya PLC aktive edilir ve inositol trifosfat reseptörleri endoplazmik retikulum veya ER üzerinde kümelenir.
PLC, membran fosfatidilinositol 4,5-bifosfatı, yoğun aktin ağı nedeniyle lokal olarak biriken inositol trifosfata veya IP3'e hidrolize eder.
IP3, ER'deki reseptörlere bağlanarak kalsiyum salınımına neden olur. Kalsiyum göstergeleri salınan iyonlara bağlanır ve yerel bir kalsiyum tepkisi göstererek floresan yayar.
IP3 aktin boyunca yavaşça yayılır, ER kalsiyum seviyesini daha da tüketir ve bir plazma zarı kalsiyum kanalını aktive ederek kalsiyum akışına yol açar.
Hücre boyunca floresan, gecikmiş küresel kalsiyum tepkisini gösterir.
Fluo-4 hücrelerini içeren lamel bir görüntüleme veya cam tabanlı odaya yerleştirin. Potansiyel olarak hücre lizizinden kaynaklanan bileşikleri uzaklaştırmak için numuneyi üç kez yıkamak için EM tamponu kullanın. Ardından, bir mililitre EM tamponu ekleyin. Odayı, 33 santigrat derecede ısıtılmış ters çevrilmiş bir floresan mikroskobu aşamasına yerleştirin. Bir mikroskopi alanı seçin ve Fluo-4 floresan sinyalini optimize etmek için gerekirse maruz kalma süresi ve gruplama dahil olmak üzere alım parametrelerini ayarlayın.
Numuneye bakteri eklemek için, hazneden 500 mikrolitre EM tamponunu dikkatlice çıkarın ve 0.05'lik bir son OD600 elde etmek için 500 mikrolitre bakteri süspansiyonu ekleyin. Hemen bir alım yapın veya bakterilerin hücrelere tortu bırakmasına izin vermek için 10 dakika bekleyin. Edinme akışının sonunda, hücrelere temas eden bakterileri ve bakteri istila bölgeleriyle ilişkili zar çıkıntılarını görselleştirmek için seçilen alanın bir faz kontrast görüntüsünü elde edin.
Edinme prosedürünü, görüntü alımlarının süresine, dosya kaydetmeye ve tüm süreci kapsayacak şekilde yeni bir alan seçimine uygun aralıklarla tekrarlayın. Edinme prosedürünün sonunda, kalsiyum sinyallerinin maksimum genliğini belirlemek için numuneye iki mikromolar kalsiyum iyonofor iyonomisin ekleyin. Sinyal stabilize olana kadar her 3 ila 5 saniyede bir, genellikle 10 dakikadan daha kısa bir süre için görüntü alın.
Kalsiyum yokluğunda floresan sinyalini belirlemek için kalsiyum şelatörü EGTA'yı 10 milimolar nihai konsantrasyona ekleyerek takip edin. Sinyal stabilizasyonuna kadar her 3 ila 5 saniyede bir, genellikle 10 dakikadan daha kısa bir süre için görüntü alın. Metin protokolüne göre görüntü analizi yapın.