Mycobacterium tuberculosis ile Monosit Kaynaklı Hücrelerin Tam Farklılaşmış Makrofaj Enfeksiyon Modeli

Çok kuyucuklu bir plakada tamamen farklılaşmış makrofajların bir kültürünü elde edin. Bu makrofajlar, toll benzeri reseptörler veya çeşitli mikrobiyal bileşenleri tanımlayan bir örüntü tanıma reseptörü olan TLR-2 gibi yüzey belirteçlerine sahiptir.

Her oyuğa uygun miktarda floresan etiketli Mycobacterium tuberculosis veya Mtb hücre süspansiyonu ekleyin ve inkübe edin.

TLR-2, fagositozu başlatan Mtb hücre duvarının karmaşık bir glikolipid bileşeni olan lipoarabinomannan veya LAM'ı tanır. Makrofaj, Mtb'yi içselleştirir ve bakteriyi zara bağlı bir bölme olan bir fagozom içinde tutar.

Fagozom, lizozomlarla birleşerek olgunlaşır ve asidik ve enzimatik açıdan zengin bir bölme olan bir fagolizozom oluşturur.

Fagolizozom içinde Mtb, asidik bir pH oluşturmaktan sorumlu vakuolar tip proton pompasını inhibe eder. Sonuç olarak, fagolizozom içindeki pH, nötre yakın hale gelir ve yutulmuş patojenleri parçalayan enzimleri devre dışı bırakır.

LAM ve TLR2 arasındaki etkileşim, aynı zamanda konak hücre sinyal yolaklarını da etkiler ve antijen sunumunda yer alan yüzey belirteçlerinin modülasyonuna yol açar.

Fagolizozomun inaktivasyonu ve konak immün yanıtının inhibisyonu, Mtb'nin makrofaj içinde kalmasını ve çoğalmasını sağlar.

Monositten türetilmiş hücreleri enfekte etmek için, bakterileri serum içermeyen ortamda mililitre konsantrasyon başına 5 kez 10 ila altıncı koloni oluşturan birime seyreltin ve altı oyuklu hücre kültürü plakasının her bir oyuğundaki süpernatanı, 1 mililitre taze serumsuz ortam ve 5'lik bir enfeksiyon çokluğu elde etmek için kuyu başına 1 mililitre bakteri süspansiyonu ile değiştirin.

Hücre kültürü inkübatöründe 4 saatlik bir inkübasyondan sonra, her bir kuyucuğu yıkama başına 1 mililitre steril yıkama tamponu ile üç kez yıkayın, her yıkamadan sonra tüm tampon hacmini kuyucukların köşelerinden çıkarmak için plakayı dikkatlice eğin. Daha sonra, MTb ile enfekte olmuş monosit türevli hücreleri antibiyotik olmadan 2 mililitre tam ortamda yeniden süspanse edin.