Vitronektinin konakçı epitel hücrelerine bakteri yapışmasındaki rolünü incelemek için bir test

JoVE Encyclopedia of Experiments

İmmünoloji

0 görüntüleme • 3:53 dk • July 8th, 2025

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yapışık epitel hücre tek katmanları içeren çok kuyulu bir plaka alın. Serum protein girişimini önlemek için ortamı serumsuz ortamla değiştirin. İnkübasyon sonrası, ortamı çıkarın. Hücreleri tampon ile yıkayın. Vitronektin içeren soğutulmuş serumsuz ortam ekleyin. Daha düşük sıcaklıklarda inkübe edin.

Vitronektinin N-terminal RGD alanı, epitel hücre yüzeyi integrin reseptörlerine bağlanır. Daha düşük sıcaklıklar, vitronektin-integrin kompleksinin hücresel içselleşmesini engeller.

İntegrin reseptörü doygunluğunu takiben, ortamı çıkarın. Bakteriyel vitronektine bağımlı integrin bağlanmasını etkileyebilecek fazla vitronektini çıkarmak için tamponla yıkayın.

Haemophilus influenzae tip f veya gram negatif bir bakteriyel patojen olan Hif süspansiyonunu ekleyin. Kuluçkaya yatmak.

Hif yüzeyindeki protein H, vitronektinin C-terminaline bağlanarak Hif'in epitel hücresine yapışmasını ve ardından içselleştirmeyi kolaylaştırır.

Ortamı çıkarın ve bağlanmamış Hif'i çıkarmak için tamponla yıkayın. Hücreleri toplamak için bir hücre ayırma enzimi kullanın. Enzimatik reaksiyonu durdurmak için serum içeren ortam ekleyin. Hücre süspansiyonunu cam boncuklar içeren bir cam tüpe aktarın. Hücreleri parçalamak, içselleştirilmiş ve yüzeye bağlı bakterileri serbest bırakmak için girdap.

Lizatı serumsuz ortamla seyreltin ve bir çikolatalı agar tabağına tohumlayın. Hif'in koloniler oluşturması için kuluçkaya yatırın. Kolonileri sayın.

Daha fazla koloni sayısı, vitronektin varlığında epitel hücrelerine Hif yapışmasının arttığını gösterir.

Metin protokolünde tarif edildiği gibi kültür A549 epitel hücreleri. Hücrelerin 37 santigrat derecede bir yıkama ve tripsinizasyonundan sonra, mililitre başına 5 mikrogram gentamisin içeren tam ortam kullanarak hücre süspansiyonunu mililitre başına 5.000 hücreye seyreltin.

Bakteriyel enfeksiyondan önce, kuyucuklardaki ortamı F12 ortamı ile değiştirin ve gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Hücre tek tabakasını oda sıcaklığında 1 mililitre PBS ile üç kez yıkayın. Ardından, plakayı buzun üzerine yerleştirin ve mililitre başına 10 mikrogram vitronektin içeren 200 mikrolitre önceden soğutulmuş F12 ortamı ekleyin.

Plakayı 1 saat boyunca 4 santigrat derecede inkübe ettikten sonra, çözeltiyi pipetleyerek atın ve hücre katmanını oda sıcaklığında 1 mililitre PBS ile iki kez yıkayın. Her kuyucuğa F12 ortamında 100 mikrolitre taze yetiştirilmiş Hif vahşi tip ekleyin. Plakayı 37 santigrat derecede 2 saat inkübe edin. Daha sonra ortamı bir pipetle aspire edin ve A549 epitel hücrelerini, hücre ayırma çözeltisinin oyuğu başına 50 mikrolitrede PBS ile üç kez yıkayın ve ardından 37 santigrat derecede 5 dakikalık bir inkübasyon uygulayın.

Daha sonra, enzimatik reaksiyonu durdurmak için oyuk başına 50 mikrolitre F12 tam ortam ekleyin. Epitel hücrelerini her bir oyuktan 4 cam boncuk içeren 6 mililitrelik bir cam tüpe aktarın. Hücreleri oda sıcaklığında 2 dakika girdapla parçalayın.

Hücre lizatını 100 kat seyrelttikten sonra, seyreltilmiş numunenin 10 mikrolitresini bir çikolata agar plakası üzerine yerleştirin. 37 santigrat derecede bir gece inkübasyonun ardından kolonileri sayın.

13:47

Bacillus anthracis ve Diğer Kapsüllenmiş Patojenlere Karşı Aşı Geliştirmede Fonksiyonel Antikorları Değerlendirmek için Opsono-Adherence Tahlili

İlgili videolar

0 Görüntüler

06:32

Haemophilus Influenzae'ye Solunum İmmün Yanıtlarının Değerlendirilmesi

İlgili videolar

0 Görüntüler

07:21

Konak Hücrelere Bakteriyel Yapışmanın Otomatik, Yüksek Verimli Tespiti

İlgili videolar

0 Görüntüler

05:57

Bakteriyel Yapışma Memeli Epitel Hücreleri üzerine In Vitro Testi

İlgili videolar

0 Görüntüler

02:44

Bakteriyel Yapışma ve İçselleştirmeyi Değerlendirmek İçeriği Değerlendirmek İçerik Bağırsak Modeli

İlgili videolar

0 Görüntüler

03:34

An In Vitro Assay to Study Arenavirus Attachment to the Host Cell

İlgili videolar

0 Görüntüler

03:55

Yem ve Av Proteinleri Arasındaki Etkileşimleri Analiz Etmek için ELISA Tabanlı Yöntem

İlgili videolar

0 Görüntüler

02:55

İnsan serumunun bakterisidal aktivitesine karşı bakteriyel dirençte vitronektinin rolünün belirlenmesi

İlgili videolar

0 Görüntüler

05:28

Anaerobik Bakteri-Konak Hücre Etkileşimlerini İncelemek İçin Bir Bakteriyel Enfeksiyon Testi

İlgili videolar

0 Görüntüler

04:25

Kanser Hücrelerinin Nötrofil Hücre Dışı Tuzaklara Yapışmasını Tespit Etmek için İn Vitro Yapışma Testi

İlgili videolar

0 Görüntüler

Son güncelleme: 22 Ağustos 2026