Ex Vivo Koşullarda HIV Patogenezini İncelemek için Bir İnsan Servikal Mukoza Enfeksiyonu Modeli

JoVE Encyclopedia of Experiments

İmmünoloji

0 görüntüleme • 4:51 dk • July 8th, 2025

Servikal uterus mukozasını bir petri kabına yerleştirin. Ektoserviks ve endoserviks mukozasını submukozadan ayırın. Mukozal tabakayı daha küçük eksplantlar halinde dilimleyin ve bunları konik bir tüpe aktarın.

İnsan immün yetmezlik virüsü tip 1 veya HIV-1'i eksplant tüpüne ekleyin. HIV-1 virüsü partikülleri açıkta kalan mukozal tabakaya yaklaşır ve konak hücre üzerindeki CD4 reseptörüne ve CXCR4 ko-reseptörüne bağlanır.

Bağlandıktan sonra, viral zarf konak hücre zarı ile birleşir ve viral RNA ve ters transkriptaz enzimi içeren bir viral kapsidi sitoplazmaya bırakır. Sitoplazmanın içinde, ters transkriptaz viral RNA'yı tamamlayıcı DNA'ya veya cDNA'ya dönüştürür.

cDNA, integrazın viral DNA'yı konakçı genomuna dahil ettiği konakçı hücre çekirdeğine hareket eder. Viral DNA, yeni virüs parçacıklarına dönüşen yeni viral RNA ve proteinlerin sentezini yönlendirir. Bu parçacıklar konakçı hücreden tomurcuklanır ve bir lipit zarfı alır.

Bağlanmamış virüsleri temizlemek için eksplantları uygun bir tamponla durulayın. Son olarak, eksplantları uygun bir ortama sahip çok kuyulu bir plakaya jelatin bir sünger üzerine yerleştirin ve inkübe edin.

Hava-sıvı arayüzü, sünger kılcal damarlar aracılığıyla oksijen maruziyetini ve besin erişilebilirliğini en üst düzeye çıkararak, aşağı akış analizi için model uygulanabilirliğini artırır.

Dokuyu incelemek için Petri kabının kapağını kesme yüzeyi olarak kullanın. Dokuyu forseps ile nazikçe tutarak, ektoserviks ve/veya endoserviks mukozasını stromal ve submukozadan bir neşter ve bıçakla ayırın ve mukoza şeritleri elde edin. Mukozayı 2 milimetre genişliğinde şeritler halinde kesin. Mümkün olduğu kadar çok submukozayı çıkarın ve atın, geriye sadece 2 milimetre kalınlığında bir doku tabakası bırakın. Ardından şeritleri 2 milimetre kalınlığında bloklar halinde kesin.

Diseksiyona devam ederken doku kurumasını önlemek için doku eksplantlarını 10 ila 20 mililitre CMT içeren yeni bir 100 milimetrelik Petri kabına aktarın. Diseksiyonun sonunda, eksplant dağılımını randomize etmek için plakayı döndürün. Steril forsepslerle, eksplantları steril 1.5 mililitrelik konik tüplere aktarın. Bir pipet kullanarak tüpteki herhangi bir ortamı çıkarın.

En iyi sonuçlar için, serviks eksplantları ameliyattan sonra mümkün olan en kısa sürede, ideal olarak ameliyat günü işlenmeli ve enfekte edilmelidir. Alternatif olarak, dokular gece boyunca 4 derecede CMT'ye batırılabilir ve diseksiyondan hemen sonra enfekte edilebilir.

HIV-1 preparatını 37 santigrat derecede bir su banyosunda çözdürün. Çözüldükten sonra, virüsü eksplantları içeren tüplere aktarın. Tüpleri bir termo-çalkalayıcıya aktarın ve 300 RPM'de sallanarak 37 santigrat derecede iki saat inkübe edin. Tüpleri her 30 ila 60 dakikada bir birkaç kez nazikçe ters çevirin.

Bu arada, altı oyuklu bir plakayı, steril fosfat tamponlu tuzlu su kuyusu başına 3 ila 4 mililitre ile doldurun. HIV-1 ile inkübasyonun sonunda, eksplantları içeren tüplerdeki tüm virüs preparatlarını dezenfektan solüsyonu içeren bir kaba atmak için bir pipet kullanın. Ardından, eksplantları PBS içeren altı oyuklu plakaya aktarmak için forseps ve bir pipet kullanın.

Eksplantların oda sıcaklığında bir dakika PBS'de dinlenmesine izin verdikten sonra, PBS'yi iki ila üç kez kuyuya hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyerek yıkayın. Ardından, PBS'yi bir pipet kullanarak dezenfektan solüsyonu içeren bir kaba atın. Her kuyucuğa 3 ila 4 mililitre yeni PBS ekleyin. Toplam üç yıkama için iki kez daha tekrarlayın. Doku kurumasını önlemek için eksplantları süngerlere aktarmadan hemen önce PBS'yi atın.

Şimdi, her bir jelatin süngerin üzerine beş ila sekiz eksplantı 12 oyuklu bir plakaya aktarmak için forseps kullanın. Plakayı inkübatöre geri koyun.

07:39

Bir

İlgili videolar

0 Görüntüler

02:49

Sıtma-HIV Ko-Enfeksiyonunun İn Vitro Hücre Kültürü Modelinin Oluşturulması

İlgili videolar

0 Görüntüler

12:34

Toplama, İzolasyon, ve İnsan endoservikal Akışı Sitometrik Analizi

İlgili videolar

0 Görüntüler

08:14

Bir

İlgili videolar

0 Görüntüler

11:56

Herpes Simplex virüs tip 1 ile murin Epidermis Ex ​​vivo enfeksiyon

İlgili videolar

0 Görüntüler

11:14

Ex Vivo İnsan lenfoid doku ve erkek Genital mukoza insan immün yetmezlik virüsü 1 ve Histoculture ile enfeksiyonun

İlgili videolar

0 Görüntüler

07:10

İnsanlaşmış NOD/SCID/IL2rγnull (hu-NSG) fare modeli HIV çoğaltma ve gecikme süresi çalışmaları için

İlgili videolar

0 Görüntüler

00:10

HIV ile ilişkili Karaciğer Patogenezi için Çift İnsanize TK-NOG Fare Modelinin Oluşturulması

İlgili videolar

0 Görüntüler

09:54

Humanized Immunoficient Mouse Modellerinde Kronik, Akut ve Yeniden Aktive HIV Enfeksiyonu

İlgili videolar

0 Görüntüler

08:15

Intravajinal HIV Maruziyeti ve HIV Enfeksiyonu Tedavisi için İnsanize NOG Fareler

İlgili videolar

0 Görüntüler

Son güncelleme: 29 Ağustos 2026