Salgılanan Embriyonik Alkalen Fosfataz Raportör Testi Kullanılarak Biyoaktif Tip-I İnterferonların Miktar Tayini

JoVE Encyclopedia of Experiments

İmmünoloji

0 görüntüleme • 3:11 dk • July 8th, 2025

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bir test örneğinde interferon-alfa ve interferon-beta gibi biyoaktif tip-I interferonları ölçmek için, tasarlanmış raportör hücreleri içeren çok kuyulu bir plaka alın. Bu hücreler, interferon-alfa ve beta ile indüklenebilir promotörün kontrolü altında salgılanan embriyonik alkalen fosfataz, SEAP, raportör geni eksprese eder.

Bilinmeyen bir tip I interferon konsantrasyonu içeren test örneğini ekleyin. Standart kontroller olarak işlev gören diğer kuyucuklara bir dizi insan tip-I interferon konsantrasyonu pipetleyin. Kuluçkaya yatmak.

Test kuyusundaki tip-I interferon, Janus kinazlarını aktive ederek belirli bir hücre yüzeyi reseptörüne bağlanır. Bu protein kinazlar, sinyal transdüserlerini ve transkripsiyon, STAT, proteinlerin aktivatörlerini fosforile eder ve bunlar dimerize olur ve spesifik bir interferon düzenleyici faktör ile bir kompleks oluşturur.

Çekirdeğe girdikten sonra, kompleks, interferon-alfa ve beta ile indüklenebilir promotördeki spesifik bir DNA dizisine bağlanır, SEAP gen transkripsiyonunu aktive eder ve ortama salgılanan SEAP enzimlerini üretir.

SEAP içeren ortamı, SEAP'a özgü bir alt tabakaya sahip çok kuyulu plaka kuyularına aktarın. SEAP, pembe alt tabakayı hidrolize ederek mor-mavi renkli bir ürün üretir.

Bir mikroplaka okuyucu kullanarak, SEAP seviyelerinin ve Tip-I interferon konsantrasyonunun göstergesi olan test ve standart kuyucuklarda ürünün emilimini ölçün.

Çizilen standart tip-I interferon eğrisinden, test numunesindeki biyoaktif tip-I interferon konsantrasyonunu belirleyin.

HEK-Blue interferon-alfa / beta raportör hücrelerini kullanarak biyoaktif tip-I interferonu ölçmek için, önce raportör hücreleri 96 oyuklu düz bir alt plakada oyuk başına 50.000 hücre yoğunluğunda 180 mikrolitrelik bir nihai hacme kadar plakalayın. Daha sonra, her bir oyuğa iki kez 20 mikrolitre yeni hasat edilmiş ko-kültür süpernatantı ekleyin. Bir dizi dahili standart kontrol ekleyin ve plakayı 18 ila 22 saat boyunca 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte inkübe edin.

Raportör hücrelerden salınan alkalin fosfataz seviyelerini belirlemek için, yeni bir düz tabanlı plakanın her bir oyuğuna 180 mikrolitre QUANTI-Blue çözeltisi ekleyin. Daha sonra, her bir oyuğa 20 mikrolitre indüklenmiş HEK-mavi interferon-alfa / beta hücre süpernatanları ekleyin ve standart interferon kontrol kuyucuklarında renk gelişene kadar plakayı 37 santigrat derecede inkübe edin.

QUANTI-Blue çözeltisi, enzimin varlığında pembeden mor-maviye değişir. Son olarak, 620 ila 655 nanometrede salgılanan alkalin fosfataz seviyelerini değerlendirmek için bir spektrofotometre kullanın ve interferon standart eğrisinin doğrusal kısmından ekstrapolasyon yoluyla tip-I interferon konsantrasyonunu belirleyin.

06:46

HIV-1 pozitif Bireylerin Plazma eksozomlann izolasyonu

İlgili videolar

0 Görüntüler

06:09

Metabolik fenotipleri farklı olarak sahip Olgunlaşmamış, Olgun ve tolerojenik Dendritik Hücrelerinin Üretimi

İlgili videolar

0 Görüntüler

07:55

Polimerik Yüzeylerde Adsorbe Protein Katmanlarında Sinyalizasyonu NF-kB/AP-1 Sinyallerini İnceleyecek Bir Makrofaj Muhabiri Hücre Tetkik

İlgili videolar

0 Görüntüler

09:13

Rift Vadisi Ateşi Virüsü Aşı Güvenliği ve Etkinliği Artırmak İçin MP-12 Gerinim NSS Gen işleyin Ters Genetik kullanma

İlgili videolar

0 Görüntüler

13:41

Human Papillomavirüs Roman T hücre epitopları Karakterizasyonu için interferon-γ Enzim bağlı immünospot Assay Kullanımı

İlgili videolar

0 Görüntüler

10:48

Gen İfade Tüm Dönemlerinde Viral Fonksiyonu sayısallaştırabilmek için vaksiniya Reporter Virüsler

İlgili videolar

0 Görüntüler

08:04

Göbek Kordon Kanı Transplantasyonu takiben, IFN-γ değerlendirin ELISpot Tahlili Varisella-Zoster Virüs spesifik hücre-aracılı bağışıklık geliştirilmesi

İlgili videolar

0 Görüntüler

10:00

Yüksek verim Kantitatif Gerçek zamanlı RT-PCR Testi Türleri I ve III İnterferon Alttipleriyle İfadesi Profilleri belirlenmesi için

İlgili videolar

0 Görüntüler

11:44

Bir Yüksek Çözünürlüklü Yöntem IRF3 fosforilasyonu bağımlı Aktivasyon Monitör

İlgili videolar

0 Görüntüler

09:35

Bir Hepatit B Virüsü Muhabir Sisteminin Geliştirilmesi Çoğaltma Döngüsü Erken Aşamaları Monitör

İlgili videolar

0 Görüntüler

Son güncelleme: 22 Ağustos 2026