Salgılanan Embriyonik Alkalen Fosfataz Raportör Testi Kullanılarak Biyoaktif Tip-I İnterferonların Miktar Tayini

Bir test örneğinde interferon-alfa ve interferon-beta gibi biyoaktif tip-I interferonları ölçmek için, tasarlanmış raportör hücreleri içeren çok kuyulu bir plaka alın. Bu hücreler, interferon-alfa ve beta ile indüklenebilir promotörün kontrolü altında salgılanan embriyonik alkalen fosfataz, SEAP, raportör geni eksprese eder.

Bilinmeyen bir tip I interferon konsantrasyonu içeren test örneğini ekleyin. Standart kontroller olarak işlev gören diğer kuyucuklara bir dizi insan tip-I interferon konsantrasyonu pipetleyin. Kuluçkaya yatmak.

Test kuyusundaki tip-I interferon, Janus kinazlarını aktive ederek belirli bir hücre yüzeyi reseptörüne bağlanır. Bu protein kinazlar, sinyal transdüserlerini ve transkripsiyon, STAT, proteinlerin aktivatörlerini fosforile eder ve bunlar dimerize olur ve spesifik bir interferon düzenleyici faktör ile bir kompleks oluşturur.

Çekirdeğe girdikten sonra, kompleks, interferon-alfa ve beta ile indüklenebilir promotördeki spesifik bir DNA dizisine bağlanır, SEAP gen transkripsiyonunu aktive eder ve ortama salgılanan SEAP enzimlerini üretir.

SEAP içeren ortamı, SEAP'a özgü bir alt tabakaya sahip çok kuyulu plaka kuyularına aktarın. SEAP, pembe alt tabakayı hidrolize ederek mor-mavi renkli bir ürün üretir.

Bir mikroplaka okuyucu kullanarak, SEAP seviyelerinin ve Tip-I interferon konsantrasyonunun göstergesi olan test ve standart kuyucuklarda ürünün emilimini ölçün.

Çizilen standart tip-I interferon eğrisinden, test numunesindeki biyoaktif tip-I interferon konsantrasyonunu belirleyin.

HEK-Blue interferon-alfa / beta raportör hücrelerini kullanarak biyoaktif tip-I interferonu ölçmek için, önce raportör hücreleri 96 oyuklu düz bir alt plakada oyuk başına 50.000 hücre yoğunluğunda 180 mikrolitrelik bir nihai hacme kadar plakalayın. Daha sonra, her bir oyuğa iki kez 20 mikrolitre yeni hasat edilmiş ko-kültür süpernatantı ekleyin. Bir dizi dahili standart kontrol ekleyin ve plakayı 18 ila 22 saat boyunca 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte inkübe edin.

Raportör hücrelerden salınan alkalin fosfataz seviyelerini belirlemek için, yeni bir düz tabanlı plakanın her bir oyuğuna 180 mikrolitre QUANTI-Blue çözeltisi ekleyin. Daha sonra, her bir oyuğa 20 mikrolitre indüklenmiş HEK-mavi interferon-alfa / beta hücre süpernatanları ekleyin ve standart interferon kontrol kuyucuklarında renk gelişene kadar plakayı 37 santigrat derecede inkübe edin.

QUANTI-Blue çözeltisi, enzimin varlığında pembeden mor-maviye değişir. Son olarak, 620 ila 655 nanometrede salgılanan alkalin fosfataz seviyelerini değerlendirmek için bir spektrofotometre kullanın ve interferon standart eğrisinin doğrusal kısmından ekstrapolasyon yoluyla tip-I interferon konsantrasyonunu belirleyin.