Bir Enflamasyon Fare Modelinde Kan Hücresi-Endotel Etkileşimlerini Analiz Etmek için İntravital Mikroskopi

Enflamasyonu indüklemek için intraperitoneal olarak lipopolisakkarit enjekte edilen anestezi uygulanmış bir fare ile başlayın.

Karın boşluğunu ortaya çıkarmak için karnı kesin. Tuzlu su ile organ hidrasyonunu koruyun. Rodamin 6G'yi retro-orbital olarak enjekte edin. Floresan boya molekülleri dolaşıma girer ve görselleştirmeleri için lökositleri ve trombositleri etiketler.

Şimdi, mezenterli damarları ile bir ileum halkasını dıştan çıkarın. Optimum görüntüleme için dokuyu önceden ısıtılmış tuzlu su ile nemli tutun. Floresan mikroskobu altında, intravital mikroskopi için mezenterli bir damara odaklanın.

Lipopolisakkarit enjeksiyonu, selektinler de dahil olmak üzere adezyon moleküllerinin yukarı regülasyonu ile endotel hücre aktivasyonuna neden olur. Dolaşımdaki trombositler endotelyuma alınır ve burada spesifik adezyon molekülü-ligand etkileşimleri yoluyla bağlanarak adezyon kompleksleri oluştururlar.

Bu etkileşimler sayesinde trombositler aktive olur ve serotonin de dahil olmak üzere molekülleri içeren granülleri serbest bırakarak lökosit alımını teşvik eder.

Lökositler endotel yüzeyine hareket eder ve aktive edilmiş trombositlere bağlanır. Ayrıca, lökositler endotel boyunca yuvarlanır ve zayıf yapışkan etkileşimler yoluyla endotel hücrelerine bağlanır. Yuvarlanma hareketi, lökosit-endotel transgöçü için çok önemli olan endotel hücrelerine sıkı bir şekilde yapışma için lökosit integrinlerini aktive eder.

İntravital mikroskopi kullanarak, endotel hücreleri ile gerçek zamanlı etkileşimlerini belirlemek için floresan lökositleri ve trombositleri görselleştirin.

İntravital görüntülemeden dört saat önce, sahte bakteriyel enflamatuar yanıtı indüklemek için 16 ila 20 gramlık 4 ila 6 haftalık bir erkek fareye kilogram LPS IP başına 20 miligram enjekte edin.

Bu sırada plastik hazneyi ve mezenter dokusunu nemlendirmek için 37 derecelik bir su banyosunda %0,9'luk bir tuzlu su solüsyonunu önceden ısıtın. Daha sonra, LPS ile tedavi edilen farede ayak parmağının sıkışmasına yanıt verilmemesi ile uygun anestezi derinliğini onaylayın ve ardından hayvanın gözlerine merhem sürün.

Karnınızı bir tıraş makinesiyle epilasyon yapın, gevşek tüyleri %70 etanole batırılmış gazlı bezle alın. Ardından, karnı açmak için küçük bir kavisli forseps ve makas kullanın.

Epigastrik damarları tanımlayın ve damarları korumak için linea alba bölgesindeki peritonu açın. Dokuyu nemli tutmak için karın boşluğuna birkaç damla önceden ısıtılmış salin uygulayın, ardından dolaşımdaki kan hücrelerini etiketlemek için 50 mikrolitre rodamin 6G'nin retro-orbital enjeksiyonu yapın. Ardından, fareyi 10 santimetrelik bir Petri kabına yerleştirin, bir ileum halkasını dışlayın ve dokuyu nemli tutmak için önceden ısıtılmış salini her iki dakikada bir uygulayın.

İntravital mikroskopi ile enflamatuar yanıtı görselleştirmek için, fareyi mikroskobun altına yerleştirin ve 200 ila 300 mikrometre çapında ve mümkün olduğunca az görünür çevredeki yağı görüş alanına mezenterli bir damar getirin.

Uygun mikroskop yazılımını kullanarak, kan hücresi-endotel etkileşimlerini fare başına 4 farklı damarda 1 dakika boyunca kaydedin. Ardından, hücreden hücreye tepkileri analiz etmek için, stabil ve bireyler arası kan akışı koşullarını onaylayın.

Yuvarlanan lökositlerin sayısını ölçmek için, damar boyunca dikey bir çizgi çizin ve bu çizgiyi 1 dakika içinde geçen tüm lökositleri manuel olarak sayın. Yuvarlanma hızını belirlemek için, damar boyunca 50 mikrometre aralıklarla iki dikey çizgi çizin ve endotel üzerinde stabil bir şekilde yuvarlanırken tek bir lökositin çizgiler arasında geçmesi için geçen süreyi ölçün.

Lökosit yapışmasını ölçmek için damarda 200 x 200 mikrometre kare çizin. Ardından, kare içinde 30 saniye boyunca görünür bir hareket göstermeyen sıkıca yapışan lökositleri manuel olarak sayın. Son olarak, trombosit-lökosit etkileşimlerini ölçmek için, bir lökosit'e bağlı trombositlerin sayısını manuel olarak sayın.