JoVE Encyclopedia of Experiments
İmmünoloji
0 görüntüleme • 3:54 dk • July 8th, 2025
Galleria mellonella'nın bir larvasını - daha büyük balmumu güvesi - ventral tarafı açığa çıkaran bir enjeksiyon platformuna yerleştirin.
Biyolüminesans üretmek için genetik olarak modifiye edilmiş canlı bir bakteriyel aşı türü olan Mycobacterium bovis BCG lux süspansiyonu içeren bir mikroşırınga alın. Süspansiyonu son proleg veya abdominal eklere enjekte edin - bakterileri hemolenf - vücut boşluğundaki dolaşım sıvısına salın.
Larvaları kontrollü bir ortama aktarın ve kuluçkaya yatırın. Bakteriler hemolenfleri zengin bir besin kaynağı olarak kullanır ve çoğalır.
Hemositler - hemolenfteki omurgasız bağışıklık hücreleri - bakterilerin etrafında kümelenir ve enfeksiyonun yayılmasını önlemek için granülom benzeri bir yapı oluşturur. Hemositler, fenoloksidaz oluşturmak için proteolitik bölünmeye uğrayan pro-fenoloksidaz salgılar.
Fenoloksidaz, enfeksiyon bölgesindeki bakterileri tutan melanini sentezler. Melanin pigmentinin birikmesi, larva renginin koyulaşmasına neden olan sistemik melanizasyona neden olur.
Hemositler bakterileri fagozomlara sokar. Fagozomlar, litik enzimler elde etmek için lizozomlarla birleşerek bakteriyel bozulmaya neden olur. Bir bakteri alt kümesi fagolizozomal bozulmadan kaçabilir ve hemositlerde bulunabilir - bu da kalıcı enfeksiyona yol açar.
Bakteriyel biyolüminesansı belirli aralıklarla ölçün. Biyolüminesanstaki ilk düşüş, etkili bir anti-bakteriyel yanıtı gösterirken, değerin platolanması kalıcı bir enfeksiyonu gösterir.
Satın alınan instar larvalarını varışta karanlıkta 18 santigrat derecede tutun ve satın alma tarihinden itibaren bir hafta içinde kullanın. Tek tip krem rengine, uygun boyut ve ağırlığa, yüksek hareketliliğe ve ters çevrildiğinde kendilerini düzeltme yeteneğine sahip olmaya dayalı deneyler için sağlıklı larvaları tanımlayın ve seçin. Künt uçlu cımbız kullanarak, sağlıklı larvaları bir filtre kağıdı tabakasıyla kaplı bir Petri kabına dikkatlice sayın ve kullanılana kadar karanlıkta oda sıcaklığında saklayın.
94 milimetre çapında dairesel bir filtre kağıdını düz, yükseltilmiş bir yüzeye bantlayarak enjeksiyon platformunu hazırlayın. Üç hacim steril PBST ile sterilize etmek, atmak ve daha fazla durulamak için 25 mikrolitrelik bir mikro şırıngaya üç hacim %70 etanol aspire edin. Daha sonra, hazırlanan BCG lux inoculum'u tekrar süspanse edin ve sterilize edilmiş mikroşırıngaya 10 mikrolitre aspire edin. Negatif kontrol için PBST'yi aspire etmek için ayrı bir şırınga kullanın.
10 enjeksiyondan sonra, düzgün hücre süspansiyonunu sağlamak için BCG lux aşısını yeniden askıya alın. Bir larvayı almak ve enjeksiyon platformuna yerleştirmek için cımbız kullanın. Platformda larvayı sırtına çevirin ve cımbızla başını ve kuyruğunu sabitleyerek hareketsiz hale getirin. Larvanın başından geriye doğru geri sayan son sol prolegi bulun ve iğnenin ucunu yatay düzleme 10 ila 20 derecelik bir açıyla 5 ila 6 mm derinliğinde dikkatlice yerleştirin. Aşıyı şırıngadan enjekte edin.
Her enfeksiyondan sonra, enfekte olmuş larvaları bir filtre kağıdı tabakası ile kaplı bir Petri kabına aktarın. Tek bir 94 milimetrelik Petri kabı 30 larvaya kadar barındırabilir. Petri kabını,% 5 karbondioksit ile 37 santigrat derecede bir inkübatörün içinde havalandırmalı karanlık bir kutuda saklayın.
Her 24 saatte bir larvaların hayatta kalmasını izleyin. Larvalar, dokunmaya tepki olarak hareket edemediklerinde ölü olarak kabul edilir. Mantel-Cox testi ile sağkalımı kaydedin ve istatistiksel anlamlılığı değerlendirin.