JoVE Deneyler Ansiklopedisi
İmmünoloji
0 görüntülenme • 3:23 dk. • July 8th, 2025
İn vivo bakteri yükünü ölçmek için, Bacillus Calmette-Guérin veya BCG lux ile önceden enfekte olmuş sterilize edilmiş böcek larvaları ile başlayın. BCG lux, biyolüminesans üreten bir enzim olan lusiferazı eksprese eden genetik olarak değiştirilmiş bir Mycobacterium bovis BCG türüdür.
Bir böcek larvasını çelik bilyeli tampon içeren bir parçalama matrisi tüpüne aktarın. Bir homojenizatör kullanarak larvaları homojenize edin ve bakteriler de dahil olmak üzere hücre içi bileşenleri tampona bırakın.
Homojenatı toplamak için tüpü santrifüjleyin ve bir luminometre tüpüne aktarın.
Hücresel parçaları çözündürmek ve artık bakterileri serbest bırakmak için matris tüpünü deterjan içeren bir tamponla yıkayın.
Fraksiyonları aynı luminometre tüpünde birleştirin ve lusiferaz substratını ekleyin. Substratlar bakterilere girer ve lusiferaz enzimleri ile etkileşime girerek biyolüminesans ile sonuçlanır. Tüpü bir luminometreye yükleyin ve biyolüminesansı ölçün.
Luminometre, yayılan ışığın yoğunluğunu ölçer ve bir böcek larvasında BCG'nin in vivo yükünün göstergesi olan bağıl ışık birimini veya RLU'yu hesaplar.
Seyreltilmiş homojenat süspansiyonu piperasilin içeren bir agar plakası üzerine yayın ve BCG'yi ayrı koloniler halinde seçici olarak büyütmek için inkübe edin. Plakadaki koloniler, koloni oluşturan birimi veya CFU'yu temsil eder. RLU / CFU oranı, biyolüminesansı bakteri canlılığı ile ilişkilendirir.
Her 24 saatte bir, rastgele beş enfekte larva seçin ve larva yüzeylerini nazikçe sterilize etmek için% 70 etanole batırılmış bir pamuklu çubuk kullanın. Larvaları tek tek 800 mikrolitre steril PBS içeren iki mililitrelik parçalama matris tüplerine yerleştirin. Ardından, larvaları saniyede altı metre hızla 60 saniye boyunca homojenize etmek için bir homojenizatör kullanın.
Homojenatı kapaklardan çıkarmak için parçalama tüplerini beş saniye boyunca 3.500 kez g'de santrifüjleyin ve homojenatı ayrı ayrı beş steril luminometre tüpüne dikkatlice boşaltın. Steril 1,5 mililitrelik bir reaksiyon tüpünde 100 mikrolitre homojenat ayırın. Parçalama matris tüplerini bir mililitre PBST ile yıkayarak kalan homojenatı geri kazanın ve ilgili luminometre tüplerine pipetleyin.
Luminometre tüplerini girdaplayın ve bir luminometre üzerindeki homojenatların biyolüminesansını ölçün. Daha sonra, PBST kullanarak 24 oyuklu kültür plakalarında ayrılmış 100 mikrolitre homojenatın 10 kat seri seyreltmelerini hazırlayın. Her bir Middlebrook 7H11 agar plakasına 10 mikrolitre seyreltme pipetleyin ve yaymak için steril bir plaka yayıcı kullanın. İki hafta boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.
Bundan sonra, koloni oluşturan birimleri sayın.