JoVE Encyclopedia of Experiments
İmmünoloji
0 görüntüleme • 3:41 dk • July 8th, 2025
Sürekli oksijen akışı ve anestezik gaz içeren bir solunum ünitesine bağlı steril cerrahi ped üzerine anestezi uygulanmış bir fare yerleştirin.
Bir filtre kullanarak şırıngayı steril hava ile doldurun. Şırıngaya bir iğne takın ve doku katmanları içinde bir hava kesesi oluşturmak için sterilize edilmiş havayı farenin arkasına deri altından enjekte edin. Kurtarma işlemine kadar fareyi izleyin.
Fareyi yeniden uyuşturun ve lipopolisakkarit, LPS'yi hava torbasına uygulayın. LPS, dokuda yerleşik makrofajlar ve dendritik hücreler üzerindeki toll benzeri reseptör 4, TLR-4'e bağlanır ve onları aktive eder.
Aktive edilmiş hücreler, nötrofilleri ve diğer bağışıklık hücrelerini çeken sitokinler ve kemokinler gibi çeşitli enflamatuar mediatörler salgılar. Bu mediatörler ayrıca yakındaki kan damarlarının vasküler geçirgenliğini artırarak bağışıklık hücrelerinin ve çözünür faktörlerin kan dolaşımından hava torbasına girmesini sağlar.
Sıvı kese içinde biriktikçe, enflamatuar hücreler ve çeşitli biyoaktif moleküller içeren bir eksüda oluşturur.
Fareyi ötenazi yapın ve hava torbasına uygun bir yıkama tamponu enjekte edin. Enflamatuar eksüdayı bir mikrosantrifüj tüpüne ve santrifüje toplayın. Süpernatanı atın ve yıkama tamponundaki hücreleri yeniden süspanse edin.
Nötrofil oranını ölçmek ve infiltrasyonlarının derecesini belirlemek için inflamatuar eksüdayı analiz edin.
Farelerin sıfırıncı günde uyuşturulmasından sonra, üç mililitrelik bir sterilize hava hacmi elde etmek için beş mililitrelik bir şırıngaya bağlı 0.22 mikronluk bir filtre kullanın. Anestezi uygulanmış farenin arka derisini cımbızla kaldırın ve sterilize edilmiş havanın üç mililitresini enjekte etmek için deri altına 26 gauge x 3/8 inçlik bir iğne kullanın.
Tedaviden sonra, fareleri solunum ünitesinden çıkarın ve iyi ayarlanmış bir kafese yerleştirin. Hareket etmeye başlayana kadar hayatta olduklarından emin olmak için fareleri izleyin. Üçüncü günde, hava kesesini korumak için önceden kurulmuş hava cebine üç mililitre daha sterilize hava enjekte edin.
Altıncı günde, hava kesesine farklı tedaviler enjekte edin. Negatif kontrol olarak bir mililitre PBS enjekte edin ve lokal inflamasyonu indüklemek için pozitif kontrol olarak mililitre LPS başına bir mililitre bir mikrogram enjekte edin. Altı saat sonra fareleri kurban edin.
Her hava torbası için, hava torbasını yıkamak ve enflamatuar eksüdayı 15 mililitrelik bir santrifüj tüpünde toplamak için bir mililitre yıkama tamponu enjekte edin. Ardından, hava torbasını iki mililitre yıkama tamponu ile iki kez yıkayın ve enflamatuar eksüdayı aynı santrifüj tüpünde toplayın.
Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 100 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı atın ve hücreleri bir mililitre yıkama tamponunda yeniden süspanse edin. Otomatik hematoloji analizörünü kullanarak nötrofil oranını ölçmek için hücreleri sayın.