Viral Enfeksiyonun Tespiti için İn Vitro Rekombinant Virüs Raportör Sistemi

JoVE Encyclopedia of Experiments

İmmünoloji

0 görüntüleme • 3:56 dk • July 8th, 2025

Bir transmembran reseptörü olan sodyum taurokolat ko-taşıyıcı polipeptit veya NTCP'yi eksprese etmek için genetik olarak modifiye edilmiş bir insan karaciğer kanseri hücre kültürünü alın.

Rekombinant hepatit B virüsü veya HBV ekleyin. Virüs, yüzey proteinlerini içeren bir dış zarf ve genomu çevreleyen bir iç nükleokapsid içerir. Bir lusiferaz raportör geninin eklenmesi, virüsün üreme yeteneğini engeller.

Viral zarf proteini, konak hücrenin NTCP reseptörüne bağlanır.

NTCP, epidermal büyüme faktörü reseptörü, EGFR ile etkileşime girer ve oligomerize ederek virüsün EGFR aracılı endositozunu indükler.

Viral zarf, nükleer gözenek kompleksinde parçalanan nükleokapsidi serbest bırakmak için endozom zarı ile birleşir.

Viral genom çekirdeğe girer ve lusiferaz da dahil olmak üzere viral proteinleri kodlayan kovalent olarak kapalı dairesel DNA'ya veya cccDNA'ya (kararlı bir şablon) dönüşür.

Önceden tanımlanmış aralıklarla, hücreleri hasat edin ve hücre içi lusiferazı serbest bırakmak için parçalayın.

Bir muhabir alt tabakasını tanıtın. Lusiferaz, substratı oksitleyerek bir sinyal üretir.

Lusiferaz aktivitesinde enfeksiyon sonrası bir artış, viral genomun sürekli ekspresyonunu gösterir.

HBV enfeksiyonuna duyarlı sodyum taurokolatı, birlikte taşınan polipeptit veya NTCP'yi stabil bir şekilde eksprese eden ve 37 santigrat derece ve% 5 CO2'de inkübe edilen plaka HepG2 hücreleri.

Enfeksiyondan bir gün önce, yaklaşık 5 x 104 HepG2 / NTCP hücresini, 0.1 mililitre kültür ortamında 96 oyuklu kollajen kaplı bir plakanın kuyucuklarına yerleştirin. Rekombinant HPV'yi 37 santigrat derece su banyosunda, şişede küçük bir buz kalıntısı kalana kadar çözdürün.

78 mikrolitre taze kültür ortamı, iki mikrolitre DMSO, 10 mikrolitre %40 PEG8000'yi 1X PBS'de ve 10 mikrolitre rekombinant HPV'yi birleştirerek enfeksiyon için ortam hazırlayın. 96 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna 100 mikrolitre rekombinant HBV çözeltisi ekleyin.

Enfeksiyondan bir gün sonra, kirletici raportör proteini virüs fraksiyonundan çıkarmak için hücreyi üç kez yıkamak için 300 mikrolitre PBS kullanın. Enfekte olmuş hücrelere% 2 DMSO içeren 200 mikrolitre kültür ortamı ekleyin ve bir hafta veya daha kısa süre inkübe edin.

HBV enfeksiyonunun analizini yapmak için, enfeksiyondan bir hafta sonra, enfekte olmuş hücreleri üç kez yıkamak için PBS kullanın. Enfekte olmuş hücrelere 50 mikrolitre lizis tamponu ekleyin. Kültür plakasını beş dakika sallayın, ardından beş dakika boyunca 2000 kez g'de santrifüjleyin. Bir luminometre plakasına 50 mikrolitre raportör substrat ekleyin, ardından plakaya 20 mikrolitre hücre lizatı ekleyin ve kısaca çalkalayarak karıştırın. Son olarak, plakayı luminometreye yerleştirin ve okumaya başlayın.

08:58

In vitro transkripsiyonu RNA tabanlı luciferase Reporter assay Poxvirus-virüslü hücrelerde çeviri Yönetmeliği çalışma

İlgili videolar

0 Görüntüler

05:21

Canlı Görüntüleme ve Viral Enfeksiyon Quantification için Bir Luciferase-floresan Reporter Grip Virüsü

İlgili videolar

0 Görüntüler

10:16

Zika Virüs Replikasyonunun inhibitörlerini taramak için yüksek verimli Antiviral Tahliller

İlgili videolar

0 Görüntüler

12:22

Herpes Çalışmaları A Primer Nöron Kültür Sistem Virüs gecikmesi ve Yeniden Simplex

İlgili videolar

0 Görüntüler

02:01

Assessing Pseudovirus Infection Using Luciferase Reporter Assay

İlgili videolar

0 Görüntüler

03:49

Viral Enfeksiyonları İzlemek için Bir Luciferase-Floresan Muhabir İnfluenza Virüsü

İlgili videolar

0 Görüntüler

10:48

Gen İfade Tüm Dönemlerinde Viral Fonksiyonu sayısallaştırabilmek için vaksiniya Reporter Virüsler

İlgili videolar

0 Görüntüler

09:29

Erken Viral Giriş Tespiti için Tahliller ve Antiviral Bileşiklerin Değerlendirilmesi

İlgili videolar

0 Görüntüler

09:35

Bir Hepatit B Virüsü Muhabir Sisteminin Geliştirilmesi Çoğaltma Döngüsü Erken Aşamaları Monitör

İlgili videolar

0 Görüntüler

11:06

Hücre görüntüleme TGF-β/Smad3 sinyal yolu Vitro ve Adenovirus muhabir sistemiyle Vivo içinde yaşamak

İlgili videolar

0 Görüntüler

Son güncelleme: 29 Ağustos 2026