JoVE Deneyler Ansiklopedisi
İmmünoloji
0 görüntülenme • 4:33 dk. • July 8th, 2025
Fare makrofajlarını içeren bir kanal slaydı alın. Kanal, ortam dolu rezervuarlara bağlanır ve makrofajlara besin sağlar.
Ortamı, makrofajları etiketleyerek spesifik yüzey glikoproteinlerine bağlanan ortam içeren floresan etiketli antikorlarla değiştirin.
Floresan etiketli hücre zarlarına sahip insan kırmızı kan hücrelerini, RBC'leri ele alalım. RBC'leri, spesifik olarak glikoforin A'ya bağlanan fare IgG antikorları ile opsonize edin.
IgG-opsonize edilmiş RBC'leri makrofaj içeren slayta ekleyin. Makrofaj Fc reseptörleri, RBC'ler üzerindeki IgG'lerin Fc bölgesini bağlar, bu da Fc reseptörlerinin temas alanı etrafında kümelenmesine ve RBC'lerin fagositoz için işaretlenmesine neden olur.
Bağlanma, hücre içi sinyal yollarını tetikler ve GTPazları aktive eder. Aktive edilmiş GTPazlar, aktinin yeniden düzenlenmesini ve polimerizasyonunu tetikleyerek filopodia adı verilen ince zar çıkıntıları oluşturur.
Ayrıca, filopodia RBC'nin etrafına uzanır ve onu gelişmekte olan fagositik kap içine alır. Kabın kenarları birleşir ve bozunma için opsonize edilmiş RBC'yi içselleştiren bir fagozom oluşturur.
Konfokal bir mikroskop kullanarak, tek fagositik olayların hızlandırılmış görüntülerini elde edin.
Peritoneal makrofajları etiketlemek için, her kanal slaytındaki bikarbonat ortamını HEPES ile desteklenmiş tam ortamla değiştirin ve slaytı, floresan etiketli fare makrofajına özgü ilgilenilen antikorun 100 mikrolitresine izin verecek şekilde eğin. Aşağı akış rezervuarına akan ortamı aspire edin ve hücreleri karbondioksit yokluğunda 37 santigrat derecede nemli bir odada 20 dakika inkübe edin.
Periton hücreleri etiketlenirken, 4 ila 2.000 kırmızı kan hücresi örneğini nazikçe karıştırın ve hücrelerin 400 mikrolitresini, yaklaşık 5 ila 8 dakika boyunca laminer bir akış başlığı içinde ısıtılmış bir alüminyum blok içinde yeni bir 2 mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
Hücreler 37 santigrat dereceye kadar ısındığında, 0.4 mikrolitre uygun bir kırmızı floresan plazma zarı boyasını hücrelerle karıştırın ve hücreleri tekrar ısı bloğuna yerleştirin. 5 dakika sonra, 1.6 mililitre taze HEPES takviyeli tam ortam ve santrifüj ekleyerek hücreleri yıkayın. Kırmızı kan hücresi topağını tanımlamak için tüpü döndürün.
1 ila 1,5 mililitrelik bir pipet ucu kullanarak, peleti bozmadan süpernatanı iki hacimde dikkatlice çıkarın. Ardından, 2.000 mikrolitre taze HEPES takviyeli tam ortamı hücrelerle karıştırın. Peleti 400 mikrolitre ortamda santrifüjleyin ve yeniden süspanse edin. Ardından, Plazma Membran Lekesi için tüp PMS'yi etiketleyin. 20 dakikalık periton hücresi etiketleme inkübasyonunun sonunda, slaytı 1 mililitre taze tam HEPES takviyeli ortamla yıkayın.
Kırmızı kan hücrelerini opsonize etmek için, PMS numune tüpüne 1 mikrolitre fare IgG2b monoklonal anti-insan CD235a antikoru ekleyin. Dakikada bir kez karıştırarak 37 santigrat derecede 8 dakika sonra, plazma zarı lekeli, IgG opsonize edilmiş insan kırmızı kan hücrelerinin 100 mikrolitresini peritoneal makrofaj içeren kanal slaytına aktarın. İnsan kırmızı kan hücreleri eklenir eklenmez, sahne inkübatörü 37 santigrat dereceye ayarlanmış bir eğirme diski disk konfokal mikroskobuna monte edin ve hemen hücreleri görüntülemeye başlayın.