JoVE Encyclopedia of Experiments
İmmünoloji
0 görüntüleme • 2:53 dk • July 8th, 2025
Başlamak için, test sırasında serum esteraz girişimini en aza indirmek için serumsuz ortamda kanser hücreleri içeren bir tüp alın. Floresan olmayan kalsein boyası ile inkübe edin.
Aktif hücre içi esterazlar, kalsein'yi sitoplazmada tutulan zar geçirimsiz floresan kalsein boyasına hidrolize eder.
Test kuyucuklarında plaka kalsein lekeli kanser hücreleri ve efektör NK hücreleri bulunurken, kontrol kuyularında sadece NK hücresi olmayan kalsein lekeli kanser hücreleri bulunur.
NK hücrelerinin aktive edici hücre yüzeyi reseptörleri, kanser hücreleri üzerindeki aktive edici ligandlara bağlanarak bir bağışıklık sinapsı oluşturur. Bu bağlanma, perforinler ve granzimler içeren sitotoksik granülleri salım için sinapsa doğru polarize ederek NK hücre sinyalini aktive eder.
Perforinler, kanser hücre zarı gözenekleri oluşturarak granzimlerin hücresel girişini kolaylaştırır ve apoptozu başlatır. Bozulmuş membran bütünlüğü, floresan kalsein sızıntısına neden olarak kanser hücresi floresansını azaltır.
Kuyuların floresan görüntülerini yakalayın.
NK hücresi içeren kuyulardaki floresan canlı kanser hücrelerinin sayısının, kontrol kuyularına göre azalması, kanser hücrelerine karşı NK hücre aracılı sitotoksisiteyi gösterir.
Kalsiyum kullanarak NK hücre aracılı sitotoksisiteyi değerlendirmek için, insan karaciğer kanseri hücre hattı hücrelerini% 70 ila% 80'lik bir birleşmeye büyüttükten sonra, gösterildiği gibi, hücreleri 3 mililitre serumsuz DMEM'de yeniden süspanse edin ve hücreleri 1.5 mikrolitre 10 milimolar kalsiyum çözeltisi ile etiketleyin oda sıcaklığında 30 dakika boyunca. İnkübasyonun sonunda, hücreleri santrifüjleme ile toplayın ve hücreleri yıkama başına 5 mililitre PBS ile iki kez yıkayın.
Hücreleri, mililitre kültür ortamı konsantrasyonu başına 1 x 105 hücrede yeniden süspanse edin ve tedavi koşulu başına üç nükte halinde 96 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna 100 mikrolitre hücre ekleyin. Daha sonra, hedef hücrelerin her bir oyuğuna 100 mikrolitre kültür ortamında 1 x 105 insan NK hücresi ekleyin ve plakayı dört saat boyunca hücre kültürü inkübatörüne yerleştirin.
İnkübasyonun sona ermesinden sonra, her bir tedavi koşulunun her bir kopyası için 10 kat büyütmede bir floresan mikroskobunda kalsiyum pozitif hücrelerin en az 10 farklı görüntü alanını yakalayın. Ardından, formülü kullanarak sitotoksisite yüzdesini hesaplayın.