Kemotaktik Uyaranlara Yanıt Olarak Doğal Öldürücü Hücre Migrasyonunun Ölçümü

Çok kuyulu bir plakaya kemokin gibi kemoatraktanlar ekleyerek başlayın.

Kuyuya uygun bir gözenek boyutunda transwell geçirgen bir oda yerleştirin. Üst hazneye doğal öldürücü veya NK hücre süspansiyonu ekleyin ve inkübe edin.

Birkaç kemokin molekülü zardan yayılır ve NK hücre reseptörlerine bağlanır. Bu, hücre iskeleti değişikliklerini teşvik eden sinyal yollarını tetikler ve alt odadaki daha yüksek kemoatraktan konsantrasyonuna doğru yönlü hücre hareketine neden olur.

İnkübasyondan sonra, alt odadan sabit miktarda göç etmiş hücreyi floresanla aktive edilen bir hücre sınıflandırmasına veya FACS tüpüne aktarın. Önceden belirlenmiş sayıda floresan sayma boncuğu ekleyin ve FACS tabanlı hücre sayımı gerçekleştirin.

Aşağıdaki formülü kullanarak, örnekteki geçirilen NK hücrelerinin mutlak sayısını belirleyin.

Nokta grafiği, floresan ve saçılma özelliklerine bağlı olarak farklı bölgeler olarak ayrılan sayma boncuklarının ve hücrelerin sayısını verir.

Kemotaktik uyaranlara yanıt olarak NK hücre göçünü ölçmek için, insan NK hücrelerini %70 ila %80'lik bir birleşik kültürden toplayın ve hücreleri, mililitre serumsuz NK hücre kültürü orta konsantrasyonu başına 2.5 x^{10 6} hücrede yeniden süspanse edin. Daha sonra, kuyucuk başına ilgilenilen NK hücresi kemoatraktanını içeren 600 mikrolitre serumsuz ortam ekleyin.

Ve her bir ortam oyuğuna 5 mikrometre gözenekli 6,5 milimetre çapında bir kültür eki yerleştirin. Daha sonra, her bir ekin üst bölmesine 100 mikrolitre NK hücresi ekleyin ve plakayı dört saat boyunca hücre kültürü inkübatörüne yerleştirin.

İnkübasyonun sonunda, yapışmayan göç etmiş hücrelerin tüm hacmini her bir kuyucuğun dibinden ayrı ayrı 5 mililitrelik FACS tüplerine aktarın ve her tüpe önceden belirlenmiş sayıda akış sitometrisi sayma boncuğundan 15 mikrolitre ekleyin. Ardından, bir akış sitometresi kullanarak, her hücre örneğini standart akış sitometrik analiz protokollerine göre değerlendirin ve formülü kullanarak taşınan NK hücrelerinin mutlak sayısını hesaplayın.