Apoptotik Timositlerin Peritoneal Makrofajlarla Efferositozunun Analizi

Efferositoz, fagositik hücrelerin apoptotik hücreleri temizlediği süreçtir.

Efferositozu analiz etmek için apoptoza duyarlı fare timositleri elde edin. Hücre geçirgen CFSE boyası ile inkübe edin.

Hücre içi esterazlar, CFSE'yi hücre geçirimsiz floresan boyaya bölerek timositleri boyar. Aşırı lekelenmeyi önlemek için ısıyla etkisiz hale getirilmiş serum ekleyin.

Lekeli timositleri bir kültür plakası üzerine koyun. Kritik hücresel sinyal kaskadını bozan ve apoptozu indükleyen bir protein kinaz inhibitörü olan staurosporin ekleyin. Ayrıca, fosfatidilserin kalıntıları, hücre zarının dış broşürüne yer değiştirerek "beni ye sinyalleri" olarak işlev görür.

Spesifik reseptör tirozin kinazları eksprese eden aktive edilmiş fare peritoneal makrofajları içeren çok kuyulu plaka kuyucuklarına artan apoptotik timosit konsantrasyonları ekleyin.

Bu kinazlar, açığa çıkan fosfatidilserini apoptotik timositler üzerine bağlayarak makrofajlar tarafından içselleştirilmelerini kolaylaştırır.

Kuluçka sonrası, serbest yüzen apoptotik timositleri çıkarın. Makrofaj CD11b moleküllerine bağlanan florofor etiketli anti-CD11b antikorları ekleyin.

Bir floresan mikroskobu kullanarak, efferositozu gösteren farklı floresan makrofajlar içindeki floresan apoptotik timositleri gözlemleyin.

Apoptotik timosit konsantrasyonu daha yüksek olan kuyucuklar, artmış içselleştirilmiş timositler gösterir.

Saf bir C57/Black-6 farenin göğüs boşluğunu açtıktan sonra timositleri toplamak için, timusu çıkarmak için kavisli ince uçlu forseps kullanın. Organı 10 mililitre RPMI-1640 ortamı içeren bir doku kültürü kabına yerleştirin. Tüm timusu 2 mikroskop lamının buzlu uçlarına karşı öğütün ve elde edilen doku süspansiyonunu 70 mikrometrelik bir hücre süzgecinden 50 mililitrelik bir tüpe süzün. Timositleri santrifüjleme ile toplayın ve peleti 40 mililitrede tekrar süspanse edin.

Saydıktan sonra, hücreleri tekrar santrifüjleyin ve 50 mililitrelik tüp başına 20 mililitre taze PBS'de 2 x 10⁸ hücreye kadar yeniden süspanse edin. Hücreleri tüp başına 20 mililitre PBS'de 5 mikromolar CFSE ile etiketleyin. Timositleri oda sıcaklığında en fazla 2 dakika inkübe etmeden önce, ışıktan koruyarak karıştırmak için tüpleri iki ila üç kez ters çevirin. Kuluçka süresinin sonunda, 10 mililitre ısıyla inaktive edilmiş at serumu ile reaksiyonu durdurun ve hücreleri santrifüjleme ile toplayın.

Etiketli hücreleri sayım ve santrifüjleme için 40 mililitre taze PBS'de yeniden süspanse edin, ardından 40 mililitre ortam ile ek bir yıkama yapın. Orta yıkamadan sonra, timositleri mililitre doku kültürü ortamı konsantrasyonu başına 7 x 10⁶ hücrede yeniden süspanse edin ve hücreleri 100 milimetrelik bir doku kültürü kabına tohumlayın. Daha sonra, hücre kültürüne 1 mikromolar final konsantrasyonunda staurosporin ekleyin ve plakayı 4 saat boyunca bir doku kültürü inkübatörüne yerleştirin.

Peritoneal makrofaj izolasyonu için, 5. günde karın derisini açmadan önce, 0. günde 1 mililitre% 3 yaşlı tiyoglikolat ile iki C57 / Black-6 faresine intraperitoneal olarak

Periton boşluğunu yıkamak için, yıkama tamponunu 50 mililitrelik bir tüpe toplanmak üzere yavaşça aspire etmeden önce 10 mililitre yıkama tamponunu boşluğa hızlı bir şekilde itmek için 18 gauge iğne ile donatılmış 10 mililitrelik bir şırınga kullanın. Periton gavajını PBS ile iki kez yıkayın. Peritoneal makrofajları, mililitre doku kültürü orta konsantrasyonu başına 2 kez 10 ila altıncı hücrede yeniden süspanse edin.

Daha sonra, 24 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna 500 mikrolitre makrofaj tohumlayın ve plakayı 2 saat boyunca bir doku kültürü inkübatörüne yerleştirin. İnkübasyonun sonunda, yüzen hücreleri çıkarmak için süpernatanı aspire edin ve her oyuğa 500 mikrolitre doku kültürü ortamı ekleyin.

Hemen kültürün her bir oyuğuna 500 mikrolitre ortamda 0 ila 12 x^{10 6} timosit ekleyin ve plakayı 4 saat boyunca doku kültürü inkübatörüne yerleştirin. İnkübasyonun sonunda, serbest yüzen apoptotik hücreleri çıkarmak için her bir kuyuyu iki kez taze PBS ile yıkayın, ardından boyama tamponu ile tek bir yıkama yapın. Daha sonra, plakaya bağlı makrofajları, oyuk başına uygun bir anti-CD11b antikoru ile desteklenmiş 200 mikrolitre boyama tamponu ile etiketleyin ve plakayı 20 dakika boyunca 4 santigrat dereceye yerleştirin.