PMN'lerde Bakteriyel Hücre Dışı Protein Aracılı Sitotoksisite için Bir Test

JoVE Encyclopedia of Experiments

İmmünoloji

0 görüntüleme • 3:14 dk • July 8th, 2025

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Monomerik S ve F bileşenlerinden oluşan gözenek oluşturan bir toksin olan lökosidin salgılayan patojenik bir bakteri olan Staphylococcus aureus kültürünü alın.

Hücreleri peletleyin ve süpernatanı seri olarak seyreltin. Lökosidin içeren süpernatanı, polimorfonükleer lökositlere veya PMN'lere sahip bir mikroplakaya aktarın ve inkübe edin.

S bileşeni, PMN'ler üzerindeki spesifik transmembran reseptörlerine bağlanır, ardından hücre zarına yerleştirmek için F bileşeni ile hetero-oligomerizasyon gerçekleşir ve bu da gözenek oluşumuna neden olur.

Gözenek, hücre içi potasyum iyonlarında azalmaya neden olarak NLR ailesi pyrin domain içeren 3 veya NLRP3 proteinini aktive eder.

NLRP3, bir kaspaz alım alanı içeren apoptozla ilişkili benek benzeri proteine veya pro-kaspaz-1'i işe alan ve bir inflamatuar oluşturan ASC'ye bağlanır.

Otomatik proteoliz, pro-kaspaz-1'i aktif kaspaz-1'e dönüştürerek hücre ölümünü tetikler.

Hücreleri belirli aralıklarla hasat edin. DNA'yı bağlamak için ölü hücrelere hasarlı zarlardan giren ve floresan yayan propidyum iyodür veya PI ekleyin.

Akış sitometrisi kullanarak, hem lökosidin konsantrasyonunun hem de inkübasyon süresinin sitotoksik etkisini değerlendirmek için PI ile boyanmış hücreleri nicelleştirin.

Kültür S. aureus deneyden bir gün önce 37 santigrat dereceye ayarlanmış bir çalkalama inkübatörü kullanarak uygun ortamda gece boyunca. Alt kültür S. aureus, gece boyunca bakteri kültürlerinin taze ortam ile 1 ila 100 oranında seyreltilmesiyle. Bakteriler erken durağan büyüme aşamasına ulaşana kadar çalkalayarak 37 santigrat derecede inkübe edin. Beş saatlik büyümeden sonra, 1 mililitre alt kültür S. aureus'u 1.5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 5000 g'da santrifüjleyin.

Santrifüjlemeyi takiben, süpernatanları aspire edin. Aspire edilmiş süpernatanları 0.22 mikronluk bir şırınga filtresinden yeni bir 1.5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne geçirin ve buzun üzerine yerleştirin. Staph aureus'u kültürlemek için kullanılan buz gibi soğuk ortamla süpernatantın seri seyreltmelerini gerçekleştirin. Daha önce açıklandığı gibi PMN'ler ve buz içeren 96 oyuklu plakanın ayrı kuyucuklarına negatif ve pozitif kontroller için nazikçe süpernatan numuneler veya ortam ekleyin.

Süpernatanları ve kuyuları dağıtmak için hafifçe kaya plakası yapın ve 37 santigrat derecede inkübe edin. İstenilen zamanlarda, plakayı inkübatörden çıkarın ve buzun üzerine yerleştirin. Her akış sitometri tüpüne 1 mikrolitre Propidium iyodür içeren 300 mikrolitre buz gibi soğuk DPBS ekleyin. Numuneleri buz üzerindeki akış sitometri tüplerine aktarın. Pozitif kontrol kuyusu için, bir akış sitometri tüpüne aktarmadan önce numuneye 20 mikrolitre %10 Triton X ekleyin. Akış sitometrisi kullanarak sarhoş PMN'lerin propidyum iyodür boyamasını analiz edin.

09:25

Bir Geçirgen Membran Ekle tabanlı Enfeksiyon Sisteminin Uygulanması memeli konakçı hücreleri üzerinde salgılanan Bakteriyel Toksinler Etkilerinin Eğitim için

İlgili videolar

0 Görüntüler

07:10

Bakteriyel gen düzenlemesi enfekte dokularda çalışmaya bir floresan tabanlı yöntemi

İlgili videolar

0 Görüntüler

07:28

İnsan Nötrofiller ve Staphylococcus aureus Biyofilmleri Arasındaki Etkileşimleri Görselleştirmek ve Ölçmek için Standartlaştırılmış In vitro Testler

İlgili videolar

0 Görüntüler

14:17

Nötrofil Ekstrasellüler Tuzaklar: Onları nasıl oluşturun ve görselleştirin için

İlgili videolar

0 Görüntüler

03:35

Fagositozu Takiben Nötrofiller Üzerinde Staphylococcus aureus Suşlarının Sitotoksisite Testi

İlgili videolar

0 Görüntüler

10:39

Vakuolar Kopma Tek Hücre ölçümleri Hücre içi patojenlerin neden

İlgili videolar

0 Görüntüler

11:31

Yalıtım Karın zarını kaynaklı Mast hücreleri ve onların fonksiyonel karakterizasyonu ile Ca2 +-görüntüleme ve Degranulation deneyleri

İlgili videolar

0 Görüntüler

07:27

Yöntemleri için algılama sitotoksik Amyloids aşağıdaki enfeksiyon pulmoner endotel hücre Pseudomonas aeruginosa tarafından

İlgili videolar

0 Görüntüler

08:47

Opsonophagocytic öldürme tahlil bakteriyel patojenlere karşı immünolojik yanıt değerlendirmek için

İlgili videolar

0 Görüntüler

12:27

İnsan Polimorfonükleer Lökositlere Karşı Staphyloccus aureus Sitortoksitesinin Ölçülmesi

İlgili videolar

0 Görüntüler

Son güncelleme: 22 Ağustos 2026