JoVE Encyclopedia of Experiments
İmmünoloji
0 görüntüleme • 3:35 dk • July 8th, 2025
Öldürücü ve daha az öldürücü Staphylococcus aureus suşlarını alın.
Bakterileri opsonize etmek için serum ekleyin.
Artan bakteri konsantrasyonlarını nötrofiller içeren soğutulmuş çok kuyulu plaka kuyucuklarına aktarın. Düşük sıcaklıklar nötrofil aktivasyonunu önler.
Senkronize fagositozu kolaylaştırmak için santrifüj.
Nötrofil reseptörleri opsoninleri bağlayarak fagozomlara bakteri içselleştirmesini tetikler.
Virulan bakterilerde, fagozomal ortam sitolitik toksinlerin ekspresyonunu tetikler.
Bu toksinler gözenekler oluşturarak fagozomları bozar ve nötrofil zar bütünlüğünü tehlikeye atar.
Bununla birlikte, daha az öldürücü bakteriler, azalmış sitolitik toksin ekspresyonu sergiler.
İnkübasyon sonrası, nötrofilleri ayırın ve bunları floresan propidyum iyodür (PI) boyası içeren akış sitometresi tüplerine aktarın.
Boya, nötrofillere bozulmuş zarlarla girer ve DNA'yı boyar.
Bir akış sitometresi kullanarak, PI boyaması için nötrofilleri analiz edin.
Virülan suşun fagositozunu takiben PI pozitif nötrofillerin oranında, daha az virülan suşla karşılaştırıldığında, konsantrasyona bağlı bir artış, virülan suşun nötrofillere karşı sitotoksisitesini gösterir.
Alt kültürlenmiş Staph aureus orta üstel büyümeye ulaştığında, 1 mililitre kültürlenmiş bakteriyi 1.5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 5000 g'da santrifüjleyin. S. aureus'u peleti rahatsız etmeden süpernatanı aspire ederek yıkayın ve peletlenmiş bakterileri 1 mililitre DPBS'de yeniden süspanse edin. Örnekleri 30 saniye boyunca vorteksleyin. Numuneleri oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 5000 g'da santrifüjleyin.
Staph aureus'u opsonize etmek için önce bakteri peletini 1 mililitre% 20 insan serumu içinde yeniden süspanse edin. Ardından, numuneleri 37 santigrat derecede 15 dakika çalkalayarak inkübe edin. Santrifüjlemeden sonra opsonize Staph aureus'u daha önce gösterildiği gibi yıkayın. Opsonize Staph aureus suşlarını buz gibi soğuk RPMI ile 1 x 108 koloni oluşturan birime, mililitre başına CFU'lara seyreltin. Numuneyi 30 saniye boyunca vorteksleyin ve buzun üzerine yerleştirin.
Bu tahliller için kullanılan Staph aureus konsantrasyonlarını, agar üzerine 1 ila 10 seri bakteri seyreltimi kaplayarak onaylayın. Nazikçe, adım 1.14'ten itibaren buz üzerinde 96 oyuklu bir plakada PMN'lere pozitif ve negatif kontroller için her bir Staph aureus suşunun veya RPMI'nin kuyu başına 100 mikrolitre ekleyin. Staph aureus'u kuyulara dağıtmak için hafifçe kaya plakası.
Fagositozu, 4 santigrat derecede sekiz dakika boyunca 500 g'da santrifüj plakası ile senkronize edin ve plakayı 37 santigrat derecede inkübe edin, santrifüjlemeden hemen sonra 0 zaman olarak. İstenilen zaman noktalarında, plakayı buzun üzerine koyun ve her akış sitometri tüpüne 1 mikrolitre propidyum iyodür içeren 200 mikrolitre buz gibi soğuk DPBS ekleyin, ardından numuneleri ilgili tüplerine aktarın.