Bakteriyel Enfeksiyonun İn Vivo Takibi için Raportör Enzim Floresan Görüntüleme

Bir fareyi Mycobacterium tuberculosis içeren aerosol damlacıklarına maruz bırakın.

Bakteriler, makrofajlar içeren alveollerin lümenine (akciğerlerdeki küçük hava keseleri) ulaşır.

Makrofaj örüntü tanıma reseptörleri, bakteriler üzerindeki patojenle ilişkili moleküler modellere bağlanarak bir fagozoma yutulmalarını tetikler.

Yutulan bakteriler, fagozom zarını yırtan özel proteinler salgılar. Bakteriler sitoplazmaya kaçar ve çoğalır.

Enfeksiyon sonrası, fareyi uyuşturun. Raportör enzim floresan veya REF görüntüleme için bakteriyel β-laktamaz enziminin bir muhabir substratını intraperitoneal olarak uygulayın.

Substrat dolaşım yoluyla akciğer alveollerine ulaşır ve enfekte olmuş hücrelere girer.

β-laktamaz içeren periplazmik boşluğa ulaşmak için bakteri dış zarına nüfuz eder.

Substrat, bir florokrom ve bir söndürücüyü birbirine bağlayan bir β-laktam halkası içerir. Yakınlık nedeniyle, florokromun floresansı söndürücü tarafından emilir.

β-laktamaz, β-laktam halkasını hidrolize ederek floroforu serbest bırakır ve floresan emisyonuna neden olur.

Mikobakteriyel enfeksiyonu değerlendirmek için floresanı görüntüleyin.

Devam etmek için, ağırlığı bilinen hayvanları güçlendirilmiş aşılama odasına yükleyin. Hazne 90 fareye kadar sığabilir. Ardından, kapıdaki tüm mandalları kapatın. Ardından, nebulizatörü çelik bir kelepçe kullanarak bağlayın. Ardından, haznedeki başlat düğmesine basın ve hava akış hızını dakikada 3 ila 5 litre arasında ayarlayın.

Basınçlı hava, inç kare başına yaklaşık 22 ila 26 pound arasında akacaktır ve daha da önemlisi, odadaki aşı sisini görmek mümkün olmalıdır. 15 dakika sonra, kontrol panelinin ön tarafında kırmızı bir ışık belirecek ve sesli bir sinyal çalışmanın sona erdiğini gösterecektir. Ardından, zamanlayıcıları sıfırlamak için sıfırlama düğmesine basın. Vakumu serbest bırakmak için haznenin kapısındaki küçük kırmızı düğmeye basın.

Ardından, oda kapısını açın ve fareleri ev kafeslerine geri koyun. İleriye dönük olarak, hayvanları muhafaza odasında tutun. Ardından, taşıma kabındaki kavanozu biyogüvenlik kabinine geri koyun. Orada, kalan bakteri süspansiyonunu belirlenmiş bir atık kabına atın. Ardından, kullanılmış nebulizatör kavanozunu bir biyolojik tehlike torbasının içine yerleştirin ve torbayı otoklava taşınmak üzere kapatın.

Hazneyi temizlemek için iç yüzeylere tamponlu fenol ve% 70 etanol püskürtün. Bu solüsyonların bu yüzeylerde 10 dakika reaksiyona girmesine izin verin, ardından iyice silin. Tüm mendilleri biyolojik tehlike çöp kutusuna atın. Ardından çöpü, atık kabını ve kullanılmış nebulizatör kavanozlarını otoklavlayın.

Hayvanları görüntüleme odasına aktarın. Orada, bir hayvanı metin protokolüne göre uyuşturun ve intraperitoneal enjeksiyon yoluyla kontrast substrat ile enjekte edin. Görüntüleme sistemi yazılımında, sistemi başlatın ve sıcaklık çubuğu yeşile döndüğünde devam edin. Sistemi başlattıktan sonra, fareyi görüntüleme odasına yerleştirin.

Burun deliklerinin burun konisinin içinde olduğundan emin olun, böylece görüntüleme sırasında anestezi alır. Şimdi bilgisayara geri dönün. Edinme kontrol panelinde, tüm hayvan görselleştirmesi için floresan, transillüminasyon veya akciğer dokularını görüntülemek için epi-aydınlatmayı seçin. Tek bir fare için, görüş alanını B ve lamba seviyesini yüksek olarak ayarlayın.

Pozlama için otomatik süre, orta gruplama ve F/Stop için iki veya üç kullanın. Ardından, uyarma filtresini 745 nanometreye ve emisyon filtrelerini 780 ila 840 nanometreye ayarlayın. Ardından, dizi kurulumuna gidin ve ilgilendiğiniz alanda 9 ila 12 transillüminasyon noktası seçin. Şimdi, görüntüleri toplamak için edin düğmesine basın.