Anaerobik Bakteri-Konak Hücre Etkileşimlerini İncelemek İçin Bir Bakteriyel Enfeksiyon Testi

Endotel hücrelerinin bir kültürü ile başlayın.

Ortamı anaerobik ortamla değiştirin. Sıcaklık dengelemesi için anaerobik bir odada inkübe edin.

Patojenik anaerobik bir bakteri olan Porphyromonas gingivalis'i ekleyin ve kısa bir süre inkübe edin.

Bakteriler, endotel hücreleri üzerindeki spesifik yapışma moleküllerine bağlanan ve bakteri yapışmasını kolaylaştıran fimbriae olarak bilinen proteinli çıkıntılara sahiptir.

Bu bağlanma, hücre içi sinyal kaskadlarını tetikleyerek aktin hücre iskeletinin yeniden düzenlenmesine ve fagozomlara bakteri içselleşmesine neden olur.

İnkübasyon sonrası, ortamı çıkarın. Yapışmamış hücre dışı bakterileri uzaklaştırmak için anaerobik bir tamponla yıkayın.

Konak hücre zarlarına nüfuz etmek ve hücre lizizini indüklemek için hafif bir deterjan ekleyin, içselleştirilmiş ve yüzeye bağlı bakterileri hasara neden olmadan serbest bırakın.

Lizat içeren bakterileri ortamla seyreltin ve seri seyreltmeler hazırlayın.

Bu seyreltmeleri kanlı agar plakaları üzerine koyun. Porphyromonas gingivalis'in çoğalmasına ve koloniler oluşturmasına izin vermek için anaerobik koşullar altında inkübe edin.

Kuluçka sonrası, yüzeye bağlı ve içselleştirilmiş bakterileri ölçmek için her plakadaki koloni oluşturan birimleri (CFU'lar) sayın, bu da bakteri-konakçı hücre etkileşimlerini gösterir.

Porphyromonas gingivalis ile kültür ve deney için, %80 azot, %10 hidrojen ve %10 karbondioksit içeren yapay bir atmosfere sahip bir vinil anaerobik oda tutulur.

Reaktifleri dengelemek için 30 kan agar plakası, 500 mililitre PBS ve mililitre vasküler endotelyal büyüme faktörü veya VEGF ortamını 24 saat önceden anaerobik odanın içine yerleştirin.

VEGF ortamındaki altı oyuklu plakalarda oyuk başına 5 insan göbek veni endotel hücresine veya HUVEC'lere 4 kez 10 kez tohumlayın ve bağlanma için gece boyunca hücre kültürü inkübatöründe bırakın. Porphyromonas gingivalis kültürlerini ekteki metinde anlatıldığı gibi beyin-kalp infüzyonunda veya BHI ortamında hazırlayın ve kültürün 660 nanometredeki optik yoğunluğu 0,5 ila 0,7 arasında değişirken kültürlerin log fazına ulaşmasına izin verin.

Bakterileri 15 mililitrelik bir tüpe aktarın ve aerobik maruziyeti önlemek için kapağın etrafına bir parça parafilm sarın. Daha sonra bakterileri 10 dakika boyunca 5.000 kez g'de santrifüjleyin. Anaerobik odanın içinde, peletlenmiş bakterileri anaerobik PBS ile yıkayın ve 10 dakika boyunca 5.000 kez g'de tekrar döndürün. Bakterileri VEGF ortamında yeniden süspanse edin.

HUVEC'leri Porphyromonas gingivalis ile enfekte etmek için, altı oyuklu plakaları inkübatörden anaerobik odaya aktarın. Ortamı test kuyucuklarından aspire edin ve anaerobik PBS ile üç kez yıkayın.

Tripan mavisi dışlama testi ile bir temsilci kuyusundan hücre numarasını belirleyin. Daha sonra, anaerobik VEGF ortamının oyuğu başına 2 mililitre ekleyin ve plakaları dengelemek için anaerobik inkübatörde 20 dakika boyunca 37 santigrat dereceye yerleştirin.

Bakterilerin optik yoğunluğunu belirleyin ve 100 ila 1 bakteri-hücre oranında çok sayıda enfeksiyonda hücreleri enfekte etmek için yeterli hacimde VEGF ortamında yeniden süspanse edin. Bakteriyel süspansiyonu hücrelere ekleyin ve enfeksiyon için 37 santigrat derecede 30 dakika inkübe edin. Hücre lizisi için, anaerobik odanın içinde, BHI ortamında hacim başına% 1 ağırlıkta bir saponin çözeltisi hazırlayın ve 0.2 mikronluk bir filtreden süzün.

Konakçı hücrelerle bakteriyel etkileşimleri incelemek için, altı oyuklu plakayı inkübatörden çıkarın ve enfeksiyon ortamını aspire edin. Anaerobik PBS ile üç kez yıkayın. Daha sonra, her bir oyuğa 2 mililitre saponin çözeltisi ekleyin ve hücre lizizine izin vermek için 15 dakika inkübe edin.

Daha sonra, hücreleri kuyu dibinden kazıyın ve hücre lizatını 1'e 1 BHI ortamı ile seyreltin. Ardından, 1'den 100'e kadar seri seyreltmeler yapın. Plaka 200 mikrolitre kanlı agar plakaları üzerine uygun bir seyreltme. Plakaları parafilm ile sarın ve koloni oluşumuna izin vermek için yedi gün boyunca 37 santigrat derece anaerobik inkübatörde inkübe edin. Ardından, bir ışık kutusu kullanarak, her plakadaki koloni oluşturan birimleri veya CFU'ları sayın.