Konak Endotel Hücreleri İçinde İçselleştirilmiş Anaerobik Bakterilerin Görüntülenmesi

Aktif olarak büyüyen Porphyromonas gingivalis, anaerobik patojenik bakterilerin süspansiyonu ile başlayın.

Floresan olmayan, hücre geçirgen bir boya olan BCECF-'yi ekleyin.

Aktif sitoplazmik esterazlar, boyayı floresan, hücre geçirimsiz bir forma hidrolize ederek bakterileri boyar.

merkezkaç. Bakterileri anaerobik ortamda yeniden süspanse edin.

Etiketli bakterileri, yapışmış insan endotel hücreleri ile lameller içeren çok kuyulu plaka kuyucuklarına ekleyin.

Anaerobik bir odada inkübe edin.

Bakteriyel fimbriyalar, endotel hücre yüzeyi reseptörlerine bağlanarak hücre içi sinyal kaskadlarını başlatır.

Bu, fagozomlar içinde aktinin yeniden düzenlenmesine ve bakteriyel içselleşmesine yol açar.

İnkübasyon sonrası, içselleştirilmemiş bakterileri uzaklaştırmak için lamelleri tamponla yıkayın.

Hücresel yapıları korumak için hücreleri paraformaldehit ile sabitleyin. Hücre içi hedeflere erişmek için hücreleri iyonik olmayan bir deterjanla geçirgenleştirin.

Aktin filamentlerine bağlanan floresan etiketli falloidin ekleyin.

Lameli DNA'yı lekeleyen DAPI içeren bir montaj ortamının üzerine yerleştirin.

Floresan aktin ile endotel hücreleri içindeki floresan Porphyromonas gingivalis'i gözlemleyin ve bakteri içselleşmesini doğrulayın.

İçselleştirilmiş bakterileri görselleştirmek için, önce otoklavlanmış cam lamelleri 12 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna aseptik olarak aktarın. Lamel üzerindeki kuyucuk başına dört HUVEC'e beş kez 10 kez plaka koyun ve 24 saat inkübe edin. Bakterileri etiketlemek için, orta log faz bakterilerini santrifüjleyin ve peleti anaerobik PBS ile yeniden süspanse edin. Tekrar santrifüjleyin ve yıkama adımını tekrarlayın.

Mililitre başına beş ila yedi kez 10 ila sekizinci bakteri içeren iki mililitre anaerobik PBS'ye 20 mikrolitre 0.2 milimolar BCECF-ekleyin. Karanlıkta 30 dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.

Kullandığımız floresan boya çoğu anaerobik bakteriyi lekeleyebilir. Bu nedenle, spesifik bir antikor gibi başka hiçbir reaktif gerekli değildir.

Bağlanmamış etiketleme reaktifini çıkarmak için bakteri süspansiyonunu 10 dakika boyunca 5.000 kez g'de santrifüjleyin ve bakterileri VEGF ortamında yeniden süspanse edin. Daha sonra, HUVEC hücrelerini 100'e 1 oranında, bakterileri hücrelere enfekte edin ve 37 santigrat derecede 30 dakika inkübe edin. İnkübasyondan sonra, enfeksiyon ortamını çıkarın ve hücreleri PBS ile üç kez yıkayın. Daha sonra% 4 paraformaldehit ekleyin ve hücreleri anaerobik odaya sabitlemek için oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin.

Sabit hücreleri hazneden çıkarın ve ardından lamelleri PBS ile üç kez yıkayın. Hücrelere nüfuz etmek için lamelleri bir mililitre% 0.2 Triton X-100'de 10 dakika inkübe edin. Daha sonra lamelleri PBS ile üç kez yıkayın. Şimdi, her bir lamel için mililitre TRITC phalloidin başına 50 mikrolitre 50 mikrogram ekleyin ve hücresel oligomerik aktini boyamak için oda sıcaklığında 45 dakika inkübe edin.

İnkübasyondan sonra, lameli PBS ile üç kez yıkayın. Nükleer boyama için mililitre DAPI başına bir mikrogram içeren yumuşak ayarlı montaj ortamı ile bir cam slayt üzerindeki lamel ters çevirin. Ardından, lamel çevresini oje ile kapatın ve konfokal mikroskopi altında gözlemleyin.