JoVE Encyclopedia of Experiments
İmmünoloji
0 görüntüleme • 4:29 dk • July 8th, 2025
Streptococcus pneumoniae süspansiyonu içeren çok kuyulu bir plaka ile başlayın.
Bakteriyel yüzey antijenleri ile etkileşime giren bakteriyel yüzey antijeni hedefleme antikorlarını tanıtın. Bu, bakterileri antikorlarla kaplar ve bağışıklık tanıma için opsonize bakteriler oluşturur.
Kuyucukları, kompleman proteinleri içeren tavşan serumu ile desteklenmiş insan periferik kan lenfosit türevi nötrofillerle tohumlayın.
İnkübasyon sırasında, C3b gibi kompleman proteinleri bakteri yüzeyinde birikir ve antikorla opsonize edilmiş bakteriler üzerinde ek opsonin kaplamasına yol açar - nötrofiller tarafından bakteri tanınmasını arttırır.
Nötrofiller üzerindeki spesifik yüzey reseptörleri, bakteriler üzerindeki opsoninlerle etkileşime girerek fagositoz yoluyla bakteri yutulmasını kolaylaştırır.
Fagozomun içinde, nötrofiller yutulan bakterileri parçalayarak tampondaki bakteri sayısını azaltır.
İnkübasyon sonrası, tek tek bakterilerin koloniler oluşturmasına izin vermek için seyreltilmiş ko-kültür çözeltisini bir kan agar plakası üzerine yerleştirin.
Opsonin ile tedavi edilen bakterilerdeki koloni sayısını tedavi edilmeyen bakterilerle karşılaştırın.
Opsonin tedavisi ile daha az koloni, daha yüksek bakteri öldürmeyi gösterir ve bu da başarılı opsonofagositik öldürmeyi düşündürür.
Bir tüp bakteri stoğunu çözün. Pelet bakterileri iki dakika boyunca 6.000 kez g ve önceki adımda elde edilen optimum seyreltmede OBB'de hücre peletini yeniden süspanse edin. Yuvarlak tabanlı 96 oyuklu bir hücre kültürü plakasında oyuk başına 10 mikrolitre yeniden askıya alınmış bakteri seyreltmesini pipetleyin. Daha sonra, her deneysel kuyucuğa iki kopya halinde 20 mikrolitre uygun bir antikor veya bir ilaç tedavisi ekleyin.
Kontrol kuyuları için, arıtma kuyuları için kullanılan tampona bağlı olarak 1X PBS veya OBB kullanın. S'yi çalkalayınample plakayı oda sıcaklığında yaklaşık 90 RPM'de bir saat boyunca çalkalayın.
Üç gün önce DMF ile muamele edilen HL60 ile farklılaşmış hücreleri hasat etmek için, hücreleri üç dakika boyunca 500 kez g oranında peletleyin. Süpernatanı atın ve peleti en az 10 mililitre 1XPBS ile yıkayın. Yıkanmış hücreleri üç dakika boyunca 500 kez g'de peletleyin. Süpernatanı atın ve OBB'deki hücreleri yeniden askıya alın.
Bir ila beş son hacimde steril seyreltilmemiş bebek tavşan serumu ekleyin. Bir saatlik bir bakteri kültüründen sonra, her numuneyi iki grup için çift oyuklara bölün. Daha sonra, her deneysel kuyucuk setine 50 mikrolitre HL60 tamamlayıcı karışımı ve sadece bakteri kuyucuklarına 50 mikrolitre OBB ekleyin. 96 oyuklu plakayı 37 santigrat derecede bir saat çalkalayın.
Numuneleri plakalamak için, her bir numunenin hacmi en az 50 mikrolitre olacak şekilde her bir kuyuyu bir ila beş son hacimde OBB ile seyreltin. Daha sonra, her numuneden 50 mikrolitreyi doğrudan bir bakteri kültürü plakasının belirlenmiş bir alanına pipetleyin ve numuneler arasında yeterli boşluk bırakın. Üzerini örtün ve numunelerin oda sıcaklığında yaklaşık 15 dakika kurumasını bekleyin.
Plakaları ve kültürü gece boyunca 30 santigrat derecede ters çevirin. Alternatif olarak, anoksik koşulların bakteri üremesini etkileyip etkilemediğini test etmek veya morfolojiyi kontrol etmek için anaerobik kavanozlardaki kültür plakaları. Gece boyunca kültürden sonra, belirlenen her numune alanındaki kolonileri sayın ve her setteki canlı hücre sayısını ilgili kontrollerle karşılaştırarak verileri analiz etmeye devam edin.
Bu tekniği ilk kez oluşturmanın en zor yönleri, muhtemelen bakteri stoğunun başlangıç CFU'larını optimize etmenin yanı sıra HL60 hücrelerinin etkili bir şekilde farklılaşmasını sağlamak olacaktır.