Konak Endotel Hücrelerinde İçselleştirilmiş Porphyromonas gingivalis'in Değerlendirilmesi

Porphyromonas gingivalis enfeksiyonu sırasında, anaerobik bakteriler üzerindeki fimbrialar, konak hücreler üzerindeki spesifik reseptörlere bağlanır.

Bu bağlanma, hücre içi sinyal kaskadlarını başlatarak aktinin yeniden düzenlenmesine ve fagozomlar içinde bakteri içselleşmesine neden olur.

İçselleştirilmiş Porphyromonas gingivalis'in endotel hücreleri içinde in vitro olarak hayatta kalmasını değerlendirmek için, lamellere yapışmış endotel hücrelerini içeren çok kuyulu bir plaka alın.

Porphyromonas gingivalis süspansiyonunu ekleyin. Bakteri içselleştirmesini kolaylaştırmak için inkübe edin.

Ortamı çıkarın ve içselleştirilmemiş bakterileri uzaklaştırmak için anaerobik bir tampon kullanarak yıkayın.

Yüzeye bağlı bakterileri ortadan kaldırmak için endotel hücrelerine geçirimsiz antibiyotik içeren ortamlar ekleyin.

Endotel hücrelerini parçalamak için hafif bir yüzey aktif madde ile inkübe edin ve bakterileri parçalanmalarına neden olmadan serbest bırakın.

Toplanan lizatı medya ile seyreltin. Lizatın seri dilüsyonlarını hazırlayın.

Seyreltmeleri kanlı agar plakaları üzerine yerleştirin. Porphyromonas gingivalis'in büyümesi ve görünür koloniler oluşturması için anaerobik koşullar altında kuluçkaya yatırın.

Porphyromonas gingivalis'in endotel hücrelerini istila etme ve içinde hayatta kalma yeteneğini değerlendirmek için kolonileri sayın.

HUVEC hücrelerinin enfeksiyonunu takiben, hücreleri anaerobik PBS ile üç kez yıkayın. Daha sonra, HUVEC hücrelerine önceden optimize edilmiş antibiyotik konsantrasyonları ile desteklenmiş 2 mililitre VEGF ortamı ekleyin. Hücreleri bir saat inkübe edin. Ortamı aspire edin ve her bir oyuğa BHI içinde 2 mililitre% 1 saponin çözeltisi ekleyin. 15 dakika inkübe edin.

Daha sonra, parçalanmış hücreleri kazıyın ve lizatı bir santrifüj tüpünde toplayın. Lizatı 1 ila 1 oranında BHI ortamı ile seyreltin ve ardından 1 ila 100'den başlayarak seri seyreltmeler hazırlayın. Plaka 200 mikrolitre kanlı agar plakaları üzerine uygun konsantrasyonlarda uygulanır. Bakterilerin anaerobik bir odada yedi gün boyunca büyümesine izin verin ve ardından kolonileri sayın.