Tümöre Özgü Antikorların İn Vivo Lokalizasyonunu Değerlendirmek İçin Bir Teknik

Bir insan yumurtalık kanseri hücresi süspansiyonunu ele alalım. Bir bazal membran matris ortamı ekleyin ve jel oluşumunu önlemek için buz üzerinde tutun.

Karışımı bir şırıngaya yükleyin ve deri altından atemik çıplak bir fareye enjekte edin. Matris jelleşmeye uğradıktan sonra iğneyi çıkarın, karışımın dışarı atılmasını önleyin.

İmmün yetmezliği olan farede bir bağışıklık tepkisinin olmaması, enjekte edilen hücrelerin canlılığını korur. Jelin hücre dışı matriks proteinleri ve büyüme faktörleri, tümör oluşumunu kolaylaştırarak büyümeyi teşvik eden sinyaller sağlar.

Tümör hücreleri, yüzeye bağlı folat reseptörü alfa-1 veya FOLR1'i aşırı eksprese eder.

FOLR1'e özgü antikorları alın. Bir floresan boya ekleyin ve inkübe edin, böylece antikorlarla boya konjugasyonuna izin verin.

Etiketli antikorları anestezi uygulanmış tümör taşıyan fareye intravenöz olarak enjekte edin.

Antikorlar dolaşım yoluyla tümöre ulaşır ve tümör hücreleri üzerindeki FOLR1'e bağlanır ve hücre yüzeyini floresan olarak etiketler.

İn vivo floresan görüntüleme gerçekleştirin. Uyarılma üzerine, boya floresan yayar ve tümördeki antikor lokalizasyonunun değerlendirilmesini kolaylaştırır.

1 litre konjugasyon tamponunda bir diyaliz kaseti kullanarak 0.5 mililitre antikoru diyaliz edin. Dört saat sonra diyaliz kasetini taze tampona aktarın ve gece boyunca diyalize girin. Bir konjugasyon reaksiyonu oluşturmak için, toplam 500 mikrolitre hacimde 1 miligram antikor başına 0.03 mikrogram IRDye 800CW ekleyin.

Karışımı 20 santigrat derecede iki saat inkübe edin. Daha sonra, etiketli konjugatları PBS'ye karşı kapsamlı diyaliz ile saflaştırın. Boyanın emilimini 780 nanometrede ve proteinin emilimini 280 nanometrede ölçerek etiketleme derecesini tahmin edin.

Fare ksenogreftlerini geliştirmek için, nazikçe, hayvanın derisini kaldırın ve alttaki kas tabakasından ayırın. 100 mikrolitre hücre süspansiyonunu 26 gauge iğne ile cilt altına yavaşça enjekte edin. İğneyi çıkarmadan önce birkaç saniye bekleyin, böylece bazal matris ortamı, cilt altındaki hücrelerle birlikte yarı katı jel benzeri bir yapı oluşturabilir, bu da karışımın enjeksiyon bölgesinden çıkmasını önleyecektir.

İn vivo görüntüleme yapmak için, boya etiketli antikoru kuyruk damarı yoluyla enjekte edin. Fareyi uyuşturduktan sonra, pedal reflekslerine yanıt verilmediğini kontrol edin ve ılık su uygulayarak damarı genişletin. 100 mikrolitrelik bir hacimde etiketli antikorun 25 mikrogramını enjekte etmek için 26 gauge iğneli 1 CC insülin şırıngası kullanın. Negatif bir kontrol olarak, kanser hücrelerini hedeflemeyen spesifik olmayan IgG izotip antikorunu etiketleyin ve enjekte edin.

Antikor enjeksiyonlarından 8, 24 ve 48 saat sonra in vivo görüntüleme gerçekleştirin. Görüntüleme yazılımında, Initialize (Başlat) öğesine tıklayın. Aşama sıcaklığının 37 santigrat derece olduğunu onaylayın. Kontrol panelinde, görüntüleme sihirbazı aracılığıyla floresan görüntülemeyi ayarlayın ve uyarımı 773 nanometreye ve emisyonu 792 nanometreye ayarlayın.

Anestezi uygulanmış fareyi görüntüleme odasına aktarın ve burun konisini kullanarak görüntüleme alanına yerleştirin. Hazır olduğunuzda, görüntü alımı için kontrol panelinde Al'ı tıklatın ve Otomatik Pozlama'yı tıklatın. Oluşturulan görüntü, optik floresan yoğunluğu sayım veya foton birimlerinde görüntülenen, fotoğrafik görüntü üzerindeki floresansın üst üste bindirilmesidir.