JoVE Encyclopedia of Experiments
İmmünoloji
0 görüntüleme • 5:27 dk • July 8th, 2025
Floresan etiketli sitoplazmik proteinlere sahip bir kanser hücresi kültürü alın.
Anti-tümör aktivitesine sahip sitokin kaynaklı öldürücü veya CIK hücreleri - doğal öldürücü hücre benzeri özelliklere sahip efektör T hücreleri - ekleyin.
CIK hücreleri üzerindeki doğal öldürücü grup 2 üyesi D veya NKG2D reseptörleri, kanser hücreleri üzerindeki strese bağlı proteinlere bağlanır.
Bağlanma, CIK hücrelerinin sitoplazmik granül toksinlerini - perforinler ve granzimleri serbest bırakmasına neden olur.
Perforinler, kanser hücre zarında gözenekler oluşturur ve kaspazları aktive eden ve apoptozu indükleyen granzimlerin girişine izin verir.
Kuluçka sonrası hücreleri hasat edin. Floresan nükleik asit bağlayıcı hücre canlılık boyası ekleyin.
Boya, hasarlı hücre zarından girer ve DNA'ya bağlanır, bu da çift lekeli ölü hücrelere neden olur.
Sağlam bir hücre zarı ile canlı hücreler boyaya karşı geçirimsizdir.
Tek floresan gösteren canlı hücreleri ve çift floresan ile ölü hücreleri tespit etmek için hücreleri bir akış sitometresinden geçirin.
CIK hücrelerinin sitotoksik etkisini ölçerek ölü kanser hücrelerinin yüzdesini ölçmek için bir dağılım grafiği oluşturun.
Sitotoksik tahlili gerçekleştirmek için, mililitre başına 0,5 milyon hücre yoğunluğunda 6 oyuklu bir plakada her bir oyuğa 1 mililitre K562 hücresi ekleyerek CIK ve insan kronik miyeloid lösemi K562 hücrelerini birlikte kültürleyin. Ardından, metin protokolünde listelendiği gibi 6 oyuklu plakaya CIK hücreleri olan veya olmayan 1 mililitre bazal ortam ekleyin. Hücre süspansiyonlarını en az üç kez hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyerek karıştırın.
Plakayı 24 saat boyunca inkübatöre yerleştirin. Şimdi, metin protokolünde listelendiği gibi, 6 oyuklu plakaya CIK hücreleri olan veya olmayan 1 mililitre bazal ortam ekleyerek CIK ve yumurtalık OC-3 hücrelerini birlikte kültürleyin. Bıçak inkübatörde 24 saat boyunca en az üç kez hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyerek hücre süspansiyonlarını karıştırın. İnkübasyonun ardından, CIK-K562 hücre süspansiyonunu doğrudan 15 mililitrelik steril bir tüpe koyun.
CIK-OC-3 gruplarından hem süspansiyonu hem de yapışan hücreleri toplamak için önce hücre süspansiyonunu 15 mililitrelik steril bir tüpe aktarın. İyiliği 1 mililitre steril PBS ile yıkayın. PBS'yi toplayın ve tüpe ekleyin. Daha sonra, 0.5 mililitre hücre ayrışma enzimi çözeltisi ekleyin ve 37 santigrat derecede beş dakika inkübe edin.
Aynı tüpten 1 mililitre çözeltiyi karşılık gelen kuyucuğa ekleyin ve 1 mililitrelik steril bir pipetle en az üç kez yukarı ve aşağı pipetleyerek hücreleri nazikçe karıştırın. Tüm hücreleri aynı tüpte toplayın. 10 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı aspire edin ve hücreleri 1 mililitre steril PBS'de yeniden süspanse edin. Hücreleri 10 dakika boyunca 300 x g'da peletleyin. Daha sonra, süpernatanı aspire edin ve hücreleri 100 mikrolitre steril PBS'de yeniden süspanse edin.
Hücre süspansiyonuna 5 mikrolitre 7-AAD boya ekleyin. 1 mililitrelik steril bir pipetle en az üç kez yukarı ve aşağı pipetleyerek hücreleri nazikçe karıştırın. 10 dakika inkübe edin ve analizden önce karanlıkta bırakın.
Sitolitik yetenek testini gerçekleştirmek için hücre süspansiyonunu karıştırın ve akış sitometrisi için hazırlığı tekrarlayın. Deneye bir numune ve tüp eklemek için Yeni Numune düğmesine tıklayın. Tüpleri metin protokolünde listelendiği gibi adlandırın.
Sitolitik test için bir saçılma geçit sistemi oluşturmak için önce Tüp 1'i seçin ve Nokta Grafiği düğmesine tıklayın. Bir FSC-A/SSC-A grafiği oluşturmak için, hücre kalıntılarını dışlamak için FSC-A eşiği 50.000'den büyük olan tüm olayların üzerine dikdörtgen bir geçit çizin. Yeni nokta grafiği için SSC-A/CFSE parametresini seçin. Ardından, yeni nokta grafiği için 7-AAD/CFSE parametresini seçin ve dört alt popülasyonu tanımlamak için dört kadranlı bir kapı çizin.
Önce boş kontrol örneğini analiz etmek için Örnek Yükle düğmesine tıklayın. SSC-A ve FSC-A'nın voltajını ayarlayın. CFSE ve 7-AAD kanal parametrelerini kullanarak ölü hücre popülasyonunu tanımlayın. Her numunede 20.000'den fazla CFSE pozitif hücreden gelen verileri kaydedin. Canlı olmayan hücre popülasyonlarını analiz etmek için her bir örneğin istatistiksel değerlerini içeren dosyaları açın ve verileri analiz dosyalarına aktarın.