JoVE Deneyler Ansiklopedisi
İmmünoloji
0 görüntülenme • 2:57 dk. • July 8th, 2025
Üstel fazda bir bakteri kültürü içeren bir tüp ile başlayın, tutarlı sonuçlar için tek tip ve aktif olarak büyüyen bakteriler sağlayın.
Hücreleri toplamak için santrifüjleyin; enkaz içeren süpernatanı aspire edin ve hücreleri yeniden süspanse edin.
Hücre geçirgen bir kırmızı floresan boya ekleyin. Boya molekülleri bakteri hücre zarına nüfuz eder ve nükleoide ulaşır, DNA ile bağlanır ve bakterilere kırmızı floresan verir.
Lekeli bakterileri peletlemek için santrifüjleyin ve bağlanmamış boya içeren süpernatanı aspire edin.
Hücre canlılığını korumak için bakterileri bir büyüme ortamına yeniden süspanse edin.
Bir fotometre kullanarak, seyreltilmiş bakteri süspansiyonunun emilimini 600 nanometrede ölçün.
Bakteri konsantrasyonunu belirlemek için absorbans değerini standart bir eğri ile karşılaştırın.
İstenilen lekeli bakteri süspansiyonu hacmini, bir büyüme ortamı içeren taze bir tüpe aktarın. Bu, enfeksiyonun çokluğunu veya MOI'yi temsil eden konak hücre enfeksiyonu için istenen bakteri konsantrasyonunu elde etmek içindir.
İstenilen MOI'ye sahip boyanmış bakteriler immünolojik çalışmalar için hazırdır.
İlk olarak, bakteri kültürlerini oda sıcaklığında iki dakika boyunca 13.000 kez g'de santrifüjleme yoluyla üstel bir fazda hasat edin. Hücre peletini bir mililitre PBS ile yıkadıktan sonra, bakteri peletini bir mililitre PBS'de yeniden süspanse edin.
600 nanometrede optik yoğunluğu ölçerek bakteriyel süspansiyon konsantrasyonlarını belirleyin. Daha sonra, bakteriyel süspansiyonu boyamak için, boyayı bir kat seyreltmek için bir mililitre bakteri süspansiyonuna 500 kat konsantre stok yeşil veya kırmızı boyama boyasından iki mikrolitre ekleyin. Hücreleri karanlıkta hafifçe döndürerek 30 dakika oda sıcaklığında inkübe edin.
30 dakika sonra, lekeli bakterileri iki dakika boyunca 13.000 kez g'de santrifüjleyin ve peleti bir mililitre PBS'de yeniden süspanse edin. Lekeli bakteri hücrelerini iki dakika boyunca 13.000 kez g'de santrifüjleme ile toplayın. Peleti bir mililitre taze F-12K ortamında yeniden süspanse edin ve her kültürün optik yoğunluğunu 600 nanometrede ölçün. Sonradan, enfeksiyonun çokluğuna ve konakçı hücre konsantrasyonuna bağlı olarak kültürleri istenen konsantrasyonlara seyreltin.