JoVE Deneyler Ansiklopedisi
İmmünoloji
0 görüntülenme • 3:40 dk. • July 8th, 2025
Sitokinler gibi uyarıcı faktörler olmadan büyüme ortamındaki lösemi hücrelerini alın ve inkübe edin.
Uyarıcı faktörlerin yokluğu, hücre içi fosforile proteinlerin defosforilasyona uğramasına ve doğal durumlarına geri dönmesine izin verir.
Ortamı santrifüjleyin ve çıkarın. Sitokin, timik stromal lenfopoietin veya TSLP içeren stroma-süpernatandaki hücreleri yeniden süspanse edin.
TSLP, lösemi hücresi üzerindeki reseptörüne bağlanarak reseptör dimerizasyonunu tetikler.
Bu, Janus ile ilişkili iki kinazı veya JAK'ları daha da yakınlaştırır ve karşılıklı transfosforilasyonu kolaylaştırır.
Aktive edilmiş JAK'lar, reseptörün sitoplazmik kuyruklarını fosforile ederek, sinyal dönüştürücü ve transkripsiyon aktivatörü, STAT monomerleri için kenetlenme bölgeleri oluşturur.
Fosforile edildikten sonra, STAT'lar aşağı akış hücresel süreçlerini düzenlemek için reseptörden dimerize olur ve ayrılır.
Hücre içi proteinlerin fosforilasyon durumlarını korumak için hücreleri sabitleyin.
Hücre zarı geçirgenliğini artırmak için hücrelere bir geçirgenlik çözeltisi uygulayın.
Fosforile proteinleri etiketlemek için floresan etiketli antikorlar ekleyin.
Floresan sinyalinin akış-sitometrik ölçümü, TSLP'nin neden olduğu STAT fosforilasyonu ile ilişkilidir.
Tasarlanmış stromadan üretilen süpernatantı doğrulamak için, kontrolden toplanan süpernatant örneklerini sitokin eksprese eden stromada çözün ve R20 ortamında koşul başına 3 kuyucuklu lösemi hücre hattını 2 kez 10 ila beşinci hücre konsantrasyonunda 96 oyuklu bir doku kültürü plakasında plakalayın. Önceki kültürlerinden gelen fosforilasyonun kaybolmasına izin vermek için hücreleri 37 santigrat derecede iki saat inkübe edin.
Daha sonra, hücreleri her bir kuyucuktan ayrı ayrı 4 mililitrelik tüplere aktarın ve hücreleri santrifüjleme ile toplayın. Peletleri deneysel koşul başına 600 mikrolitre olarak yeniden süspanse edin ve her koşul için üç kopya halinde oyuk başına 200 mikrolitre hücre plakalayın. Hücreleri, spesifik ticari fosfo-tahlillere göre uygun süre boyunca inkübe edin.
İnkübasyonun sonunda, hücreleri santrifüjleme ile peletleyin ve hücreleri üreticinin protokolüne göre fosfo-akış sitometrisi boyama yoluyla etiketleyin. Daha sonra, stroma süpernatantındaki sitokinin lösemi hücrelerini fosforile ettiğini doğrulamak için standart akış sitometrik analiz protokollerini kullanarak hücreleri akış sitometrisi ile analiz edin.