Mesane Biyopsi Kesitlerinde Bakterilerin Floresan In Situ Hibridizasyon ile Görüntülenmesi

Üropatojenik bakteri içeren deparafininize edilmiş ve rehidre edilmiş enfekte idrar kesesi biyopsi doku kesiti taşıyan bir cam slayt ile başlayın.

Floresan etiketli evrensel probları tanıtın - bakteriyel 16s ribozomal RNA veya 16s-rRNA'nın korunmuş bölgesine özgü tamamlayıcı bir tek sarmallı oligonükleotid.

Optimum hibridizasyon için slaydı karanlıkta yüksek bir sıcaklıkta inkübe edin.

İnkübasyon sırasında, problar yalnızca bakteriyel 16s-rRNA üzerindeki korunan bölgeye hibridize olur ve bakterilere yeşil floresan verir.

Hibridizasyon sonrası, bağlanmamış probları çıkarmak için önceden ısıtılmış bir tamponla yıkayın.

Doku bölümünü Hoechst boyası ve florofor etiketli hücresel protein belirteçleri ile boyayın.

Hoechst molekülleri DNA'ya bağlanarak çekirdekleri maviye boyarken, florofor etiketli belirteçler müsin ve aktin filamentleri gibi spesifik hücre bileşenleri ile etkileşime girerek biyopsi bölümünde kırmızı floresan verir.

Slaytı yıkayın ve kağıt mendil bölümüne montaj ortamı ekleyin.

Konfokal mikroskop altında, kırmızı floresan taşıyan mesane biyopsi bölümündeki yeşil floresan, doku ile ilişkili bakterileri doğrular.

Bir P1000 uç kutusunun haznesine ıslatılmış, buruşuk, hassas bir görev mendili ve steril su ekleyerek her prob için bir nemlendirme odası hazırlayın. Uç tutucu kartuşunu üstüne yerleştirin, çünkü kızakların oturacağı yer burasıdır. Son yıkama tamamlandığında, sürgüyü sürgü rafından çıkarın ve kağıt mendil tarafı yukarı bakacak şekilde yeni bir kağıt havlu üzerine yerleştirin. Slaytı kurutmak için hassas bir görev mendili kullanın, suyu uzaklaştırmak için biyopsi bölümünün üzerine değil, yalnızca yakınına hafifçe vurmaya dikkat edin. Hidrofobik bir kalem kullanarak, biyopsi bölümünün etrafına bir kenarlık çizin ve kayar dokuyu yukarı bakacak şekilde nemlendirme odasına yerleştirin.

Ardından, nemlendirme odasını 50 santigrat dereceye ayarlanmış bir inkübatöre yerleştirin. 50 ila 150 mikrolitre boyama solüsyonunu doğrudan dokunun üzerine pipetleyin, böylece doku etrafındaki hidrofobik sınır tarafından yapılan dikdörtgen doldurulur ve kutuyu nazikçe kapatın. Karanlıkta gece boyunca 50 santigrat derecede inkübe edin. Kuluçka makinesinin bir penceresi varsa, karanlık bir ortam yaratmak için alüminyum folyo ile örtün.

Ertesi sabah, kızakları nemlendirme odalarından çıkarın ve kalan hibridizasyon solüsyonunu hassas bir görev mendiliyle hızla uzaklaştırın. Ardından, slaytları dikey bir boyama rafına yerleştirin. Boyama rafını, 10 dakika boyunca 100 ml önceden ısıtılmış yıkama tamponu içeren alüminyum folyo sarılı bir coplin kavanozuna yerleştirin. Yeni coplin kavanozlarında taze yıkama tamponu ile bu yıkama adımını iki kez daha tekrarlayın.

Bu yıkama adımları sırasında, Hoechst 33342'nin bir stok çözeltisini yıkama tamponunda 1 ila 1.000 oranında seyrelterek karşı lekeyi hazırlayın. Aynı tüpe, Alexa-555 buğday tohumu aglütinini mililitre başına beş mikrogramlık bir nihai konsantrasyona ve Alexa-555 phalloidin'i 33 nanomolar nihai konsantrasyona ekleyin. Kullanıma hazır olana kadar karanlıkta saklayın.

Son yıkama tamamlandığında, slaytları coplin kavanozundan çıkarın ve fazla yıkama tamponunu hassas bir görev mendiliyle nazikçe fitilleyin. Slaytları doku tarafı yukarı bakacak şekilde bir kağıt havlu üzerine yerleştirin ve hidrofobik sınırın dolması ancak taşmaması için doğrudan dokunun üzerine 50 ila 150 mikrolitre karşı leke ekleyin. Dört slayta kadar bir kriyobox üst ile örtün ve oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin.

Bundan sonra, slaytları tekrar boyama rafına yerleştirin ve her yıkama 10 dakika sürecek şekilde taze yıkama tamponu içeren coplin kavanozlarında iki kez daha yıkayın. Ardından, slaytları iyice kurulayın ve doku tarafı yukarı bakacak şekilde bir kriyobox üst kısmının altındaki bir kağıt havlunun üzerine yerleştirin. Bir damla montaj ortamını doğrudan dokunun üzerine sıkın ve üstüne uygun boyutta bir lamel yavaşça yerleştirin. Nazikçe, baloncukları bastırın ve kapakla kayan slaytların karanlıkta gece boyunca kürlenmesine izin verin. Ertesi gün, lamellerin kenarlarını hafif bir kat şeffaf oje ile slayta kapatın ve karanlıkta 4 santigrat derecede saklamadan önce 10 dakika karanlıkta kurumaya bırakın.

Lekeli biyopsileri görüntülemeye hazır olduğunuzda, konfokal mikroskobu ve mikroskopla ilişkili yazılımı açın. FISH pozitif bir slaytla başlayın ve bilgisayar görselleştirme moduna geçin. 405, 488 ve 555 için kanalları seçin. İğne deliğini, bu durumda 555 olan en uzun dalga boyu kanalını kullanarak ayarlayın. Ardından, 488 kanalındaki etiketli bakterilerin görselleştirilmesi için mevcut odak düzlemini bulun. Odak düzlemini değiştirmeden, her kanal için kazancı, lazer gücünü ve ofseti, sinyal doygun olmayacak ve arka plan aşırı düzeltilmeyecek şekilde ayarlayın. Görüntüyü her üç kanalda da elde edin.