JoVE Encyclopedia of Experiments
İmmünoloji
0 görüntüleme • 3:54 dk • July 8th, 2025
Jurkat hücrelerinin bir süspansiyonunu alın - T lenfosit lösemi hücreleri.
Bir alikotu bir hücre canlılığı boyası ile karıştırın ve yeterli sayıda canlı hücre olduğundan emin olun.
Hücreleri bir kültür kabına koyun ve gereken süre boyunca ultraviyole C veya UVC radyasyonu uygulayın.
UVC hücrelere nüfuz eder ve DNA tarafından emilerek pirimidin fotoürünleri oluşturur.
Işınlama sonrası, hücreleri inkübe edin. Geniş UVC aracılı DNA hasarı, dış mitokondriyal membran üzerindeki pro-apoptotik proteinleri aktive ederek içsel apoptoz yolunu başlatır.
Aktive edilmiş proteinler oligomerleşir, zar gözenekleri oluşturur ve zarlar arası boşluktan sitoplazmaya sitokrom C salgılar.
Sitokrom C, apoptotik proteaz aktive edici faktör-1 ile kompleks oluşturarak bir apoptozom kompleksi oluşturur. Apoptozom, kaspazları aktive ederek apoptoza neden olur.
Bir apoptotik hücre markörü olan zar üzerindeki fosfatidilserini etiketlemek için florofor etiketli ek V ekleyin ve DNA'yı etiketlemek için hasarlı zardan giren propidyum iyodür ekleyin.
Akış sitometrisi kullanarak, annexin V işaretli erken apoptotik hücreleri ve çift lekeli geç apoptotik hücreleri belirleyin.
Jurkat T hücrelerini, el yazması talimatlarına göre 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte takviye edilmiş bazal hücre kültürü ortamında kültürleyerek başlayın. Jurkat T hücreleri, her üç günde bir önceden ısıtılmış kültür ortamına geçiş yoluyla korunabilen bir süspansiyon hücre hattıdır.
Apoptotik hücreleri, geçtikten sonra üç ila dört gün süren% 90 birleşim noktasına kadar büyüterek hazırlayın. Bu protokol için yeterli sayıda hücre elde etmek için hücreleri beş T75 şişesinde büyütün. Hücreler hazır olduğunda, şişe içeriğini yaklaşık 24 mililitre aspire edin ve bunları 50 mililitrelik konik bir tüpe aktarın. Tripan mavisi boyama ve bir hemositometre kullanarak hücreleri sayın.
Hücreleri beş dakika boyunca 271 kez g'de santrifüjleme ile peletleyin ve süpernatanı atın. Ardından, mililitrede üç milyon hücre elde etmek için ortamdaki hücreleri yeniden askıya alın. Hücreleri 100 x 20 milimetrelik doku kültürü kaplarına yerleştirin ve tabak başına beş mililitre hücre aktarın.
Yaklaşık dokuz kültür yemeği hazırlayın. Bir tabağı maruz kalmayan bir kontrol olarak bir kenara koyun ve kalan tabakları UV'ye maruz bırakın. Enerji düğmesine basarak ve sayısal tuş takımı ile "600" girerek UV çapraz bağlayıcıyı doğru enerji seviyesine ayarlayın. UV'ye maruz kalma sırasında doku kültürü kabının üst kapağını çıkardığınızdan emin olarak, kontrol dışındaki tüm bulaşıkları hücrelerle ışınlayın.
Ardından, tüm yemekleri bir hücre kültürü inkübatöründe 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte dört saat boyunca inkübe edin. İnkübasyondan sonra, ışınlanmış tüm hücreleri 50 mililitrelik konik bir tüpte birleştirin ve beş dakika boyunca 271 kez g'de santrifüjleme ile peletleyin. Süpernatanı atın ve hücreleri 24 mililitre steril PBS'de yeniden süspanse edin. Tüpü tekrar santrifüjleyin ve süpernatanı çıkarın.