Lenfosit Alt Tiplerini Karakterize Etmek için Üç Boyutlu Kantitatif Faz Görüntüleme

Bir lenfosit alt tipi süspansiyonu bir görüntüleme odasına yükleyin.

Odayı 3D kantitatif faz görüntüleme mikroskobu aşamasına yerleştirin.

Optimum görüntüleme için mikroskop parametrelerini ve odak düzlemini ayarlayın.

Lenfosit görüntüleme sırasında, lazer ışını referans ve örnek ışınlarına ayrılır.

Numune ışınının yolunda bir mikro ayna dizisine sahip olan Dijital Mikro Ayna Cihazı, ışının optik eksen etrafında 360 derece dönmesini sağlar.

Lenfositten geçen her ışın, hücre içindeki kırılma indisi değişimlerine bağlı olarak bir faz kaymasına uğrar.

Elde edilen numune ve referans ışınları yeniden birleşerek bir 2D hologram oluşturur.

Farklı açılardan faz ve genlik bilgilerini içeren bir hologram dizisi, lenfosit etrafındaki ışın dönüşü yoluyla yakalanır.

Lenfositler hariç, farklı aydınlatma açılarına sahip birden çok arka plan hologramı edinin.

Kırınım tomografisi algoritmasını kullanarak, hologramları bir 3D kırılma indisi tomogramına yeniden oluşturun ve etiketlemeye gerek kalmadan lenfositlerin morfolojik ve biyokimyasal bilgilerini sağlayın.

Optimum görüntüleme için, her hücre örneğini mikrolitre RPMI ortamı başına 180 hücre konsantrasyonuna seyreltin ve ilk seyreltilmiş numunenin 120 mikrolitresini bir görüntüleme odasına yavaşça enjekte edin. Hazne içinde kabarcık olmadığını doğruladıktan sonra, bir 3D kantitatif faz mikroskobunun objektif merceğine bir damla damıtılmış su yerleştirin ve görüntüleme haznesini mikroskobun translasyon aşamasına yerleştirin. S'yi ayarlayıntage, örnek objektif lens ile hizalanır ve sırasıyla objektif ve kondansatör lenslerinin eksenel konumlarını ayarlamak için görüntüleme yazılımının mikroskop perspektifinin Kalibrasyon sekmesinde Odak ve Yüzey'e tıklayın.

Objektifi ve kondansatör lensleri hizalamak için Otomatik Mod'a tıklayın. Hizalamayı optimize etmek için Tarama Modunu açın ve dijital mikro ayna cihaz desenini merkeze hizalamak için lensleri manuel olarak ayarlayın. Ardından, Normal Mod'a dönün ve görüş alanındaki bir hücreyi bulmak için çeviri aşamasını ayarlayın. Ekranda görüntülenen örnek sınırı neredeyse görünmez olana kadar odak düzlemini bulmak için objektif merceğin eksenel konumunu ayarlayın.

Optimal bir 3D RI tomogramı oluşturmak için hücrenin odağını mükemmel bir şekilde ayarlamak önemlidir. Görüntü düzgün bir şekilde çekilmezse, 3D rekonstrüksiyon bozulacak ve gürültülü bir tomograma neden olacaktır.

Hücresi olmayan bir konum bulmak için çeviri aşamasını ayarlayın ve farklı aydınlatma açılarına sahip birden çok 2B hologramı ölçmek için Ayarla'ya tıklayın. Görüş alanının ortasındaki bir hücreyi bulmak için çeviri aşamasını ayarlayın ve Alma sekmesi altında, görüntülenen örneği adlandırın.

Hücrenin hologramlarını, az önce ölçülen 2B hologramlarla aynı aydınlatma açılarını kullanarak ölçmek için 3B Anlık Görüntü'ye tıklayın. Elde edilen veriler veri yönetimi panelinde göründüğünde, Veri'ye sağ tıklayın ve görüntüleme yazılımında uygulanan kırınım tomografisi algoritmasını kullanarak 2B hologramlardan bir 3B kırılma indisi tomogramı oluşturmak için İşlem'e tıklayın. Görüntüleme işleminden sonra Veri Yönetimi panelinde Veri üzerine sağ tıklayınız ve verileri görselleştirmek için Aç'a tıklayınız.

Hücreyi yeniden konumlandırmak için ortasını tıklatın ve Veri Yöneticisi panelinde RI Tomogram'ı tıklatın. Preset (Ön Ayar) sekmesinde, Load (Yükle) seçeneğini tıklatın ve tomogramı 3D RI dağılımlarına göre görselleştirmek için görüntüleme yazılımı tarafından sağlanan önceden tanımlanmış bir aktarım işlevi olan lymphocytes.xml çift tıklayın. Yakınlaştırmak için fareyi kaydırın ve hücreyi herhangi bir yönde döndürmek için sürükleyin.