Kandan Manyetik Cam Parçacık Aracılı Nükleik Asit Ekstraksiyonu için Bir Teknik

Yeni çekilmiş insan kanı içeren bir tüp alın ve bir lizis tamponu ekleyin.

Tampondaki deterjan hücre zarına nüfuz eder, hücreleri parçalar ve hücre içi nükleik asitleri veya NA'ları ve nükleazları serbest bırakır.

Tampondaki kaotropik ajanlar nükleazları denatüre ederek NA bozulmasını önler.

Manyetik cam parçacıkları veya MGP'ler - silika kaplı manyetik parçacıklar - ekleyin ve iyice karıştırın.

Tamponun düşük pH'ı silikayı protonlayarak MGP'lerin yüzeyinde pozitif bir yük oluşturur.

Negatif yüklü NA'lar, yüklü yüzeye elektrostatik olarak bağlanarak bir NA-MGP kompleksi oluşturur.

Manyetik bir alan altında, NA-MGP kompleksleri tüpün yanında toplanır.

Hücre kalıntıları ve proteinler içeren süpernatanı atın.

NA-MGP komplekslerini bir yıkama tamponunda yeniden süspanse ederek, kompleksleri toplamak için bir manyetik alan uygulayarak ve süpernatanı kalan kirleticilerle birlikte atarak birden fazla yıkama adımı gerçekleştirin.

Kompleksleri bir elüsyon tamponunda yeniden süspanse edin. Yüksek pH, NA-MGP etkileşimini bozarak NA'ları serbest bırakır. Ayrıştırılan NA'lar, aşağı akış tahlilleri için hazırdır.

Toplanan kandan nükleik asitleri saflaştırmak için, vakum tüpünü elle 5 ila 10 kez çevirerek tüpün içeriğini tekrar karıştırın. Hazırlanan MGP alikotunu doğrudan kan alma tüpüne dökün, ardından numuneyi içeren tüpün üzerine kullanılmayan bir kan alma tüpünden yeni bir kapak yerleştirin. Tüpün sıkıca kapatıldığından emin olmak için kapağın üzerine bir parmak yerleştirin ve tüpün içeriğini 5 ila 10 kez çevirerek karıştırın.

Tüpü manyetik tutucuya yerleştirin ve tüpün sıkıca kapatıldığından emin olmak için parmağınızı kapağın üzerinde tutun. Ardından, MGP'leri mıknatısla birlikte tüpün yanında toplanmadan önce dağıtmak için manyetik tutucuyu tüple birkaç kez çevirin. Tüpün kapağını çıkarın ve tüpün içeriğini tek kullanımlık bir pipet kullanarak 50 mililitrelik bir toplama tüpüne atın.

Hazırlanan WB1 alikotunu doğrudan kan alma tüpüne dökün ve tüpün kapağını kapatın. İçeriği elle 5 ila 10 kez karıştırın. Ardından, mıknatısı kullanarak tüpün yan tarafındaki boncukları toplayın ve sıvıyı daha önce olduğu gibi çıkarın. WB2'nin hazırlanan alikotundaki boncukları yeniden askıya alın. Daha sonra çözeltiyi atın ve prosedürü hazırlanan WB3 alikotu ile tekrarlayın.

Son olarak, tüpü manyetik tutucudan çıkarın ve hazırlanan EB alikotunu doğrudan kan alma tüpüne dökün. Kapağı tüpün üzerine yerleştirin ve parmağınızla 5 ila 10 kez vurarak MGP'leri yeniden askıya alın. Son olarak, yeniden askıya alınan MGP'lerin bir damlacığını aşağı akış nükleik asit amplifikasyon reaksiyonu karışımına aktarmak için 1.5 mililitrelik tek kullanımlık bir pipet kullanın.