Desteklenen Bir Lipid Çift Tabakası Üzerinde NK Hücre İmmünolojik Sinaps Oluşumunun Süper Çözünürlüklü Görüntülenmesi

Fosfolipidler ve biyotinile fosfolipidlerden oluşan, desteklenen bir lipid çift tabakası veya SLB ile bir oda slaytı hazırlayın.

Spesifik olmayan etkileşimleri önlemek için bloke edici proteinler ekleyin.

Biyotinile fosfolipidlere bağlanan streptavidin'i tanıtın.

İmmobilize streptavidin'e bağlanan biyotinile floresan etiketli anti-CD16 antikorları ekleyin.

Streptavidin'in hücrelere spesifik olmayan bağlanmasını önlemek için D-biotin pipetleyin.

Doğal öldürücü veya NK hücrelerini tanıtın. Bu hücrelerdeki CD16 reseptörleri, spesifik olarak SLB'ye bağlı anti-CD16 antikorlarına bağlanarak immünolojik bir sinaps oluşturur.

Bu bağlanma, aktinin yeniden düzenlenmesini ve mikrotübül polarizasyonunu tetikler ve sonunda sinaps merkezinde SLB'ye bağlı anti-CD16 antikorları ve CD16 reseptörleri içeren mikrokümeler oluşturur.

Perforin içeren litik granüller polarize olur ve sinapstaki aktin filamentlerinden nüfuz eder.

Hücreleri düzeltin. Membranları ve SLB'yi geçirgenleştirin.

Sırasıyla aktin filamentlerine ve perforine bağlanan floresan etiketli phalloidin ve anti-perforin antikorlarını ekleyin.

Süper çözünürlüklü bir floresan mikroskobu kullanarak, sinapstaki floresan aktin filamentlerinin ve perforin pozitif granüllerin dağılımını görselleştirin.

Cam destekli düzlemsel lipid çift tabakasını monte etmek için önce bir beherde 1 ila 3 oranında% 30 hidrojen peroksit ile sülfürik asit karıştırarak 100 mililitre piranha çözeltisi hazırlayın. Bu çözeltiye, 20 ila 30 dakika boyunca iki dikdörtgen # 1.5 lamel yerleştirin. Lameller temizlenirken, önceden hazırlanmış 400 mikromolar DOPC lipidlerinden bir tüp ve önceden hazırlanmış 80 mikromolar Biotin-PE lipidlerinden bir tüp alın. Onları buz üzerinde argon tankına taşıyın.

Yeni bir mikrosantrifüj tüpünü argon ile oksijenden arındırdıktan sonra, DOPC ve Biotin-PE'yi 1'e 1 oranında birleştirin. Spesifik hacim deneysel ihtiyaçlara göre değişecektir, ancak her biri en az 2 mikrolitre olmalıdır. Karışım tüpünü ve tek tek reaktif tüplerini buzdolabına geri koymadan önce oksijenden arındırın.

Temizlik bittikten sonra, lamelleri damıtılmış suyla iyice durulayın. Lamelleri birkaç dakika havada kurumaya bırakın. Daha sonra, lipozom karışımından 1.5 mikrolitre çekin ve tek bir damla halinde bir oda slaytının şerit odalarından birine alikot edin. Şerit başına iki damla kullanılması tipiktir ancak gerekli değildir.

Şimdi, kuru lamel damlacıkların üzerine hızlı ve verimli bir şekilde yerleştirin. Lamel yerleştirildikten sonra birleşmemeleri için damlaların yeterince aralıklı olduğundan emin olun. Ayrıca, damlaların oda duvarlarının kenarlarına dokunmadan dairesel ve iyi tanımlanmış kaldığından emin olun. Lamel ve sürgü arasında su geçirmez bir sızdırmazlık sağlamak için her şeridin arasında ve çevresinde sıkıca bastırın.

Bir işaretleyici kalem kullanarak damlaların konumlarını işaretleyin. Ardından, çift tabakayı bloke etmek için 100 mikrolitre sulu %5 kazeini hazneden geçirin. Akış odasında kabarcık olmadığından emin olmaya çalışın. Daha sonra, her şeride mililitre başına 333 nanogram konsantrasyonda 100 mikrolitre streptavidin enjekte edin.

Oda sıcaklığında 10 ila 15 dakika inkübe ettikten sonra, fazla streptavidini çıkarmak için her şeritten %1 insan serum albümini ile 3 mililitre HEPES tamponlu salin geçirerek yıkayın. Metin protokolünde açıklandığı gibi, daha önce belirlenen protein konsantrasyonunda 100 mikrolitre biyotinillenmiş, floresan etiketli anti-CD16 ekleyin.

Karanlıkta 20 ila 30 dakika inkübe edildikten sonra, her şeritten% 1 insan serum albümini ile 3 mililitre HEPES tamponlu salin geçirerek tekrar yıkayın. Daha sonra, fazla streptavidin'i bağlamak ve böylece streptavidinin hücrelere spesifik olmayan bağlanma şansını ortadan kaldırmak için hazneden 25 nanomolar konsantrasyonda 100 mikrolitre D D-biotin akıtın

Daha sonra, insan NK hücrelerini sayın ve% 1 insan serum albümini ile HEPES tamponlu salin içinde mililitre başına 500.000 konsantrasyonda yeniden süspanse edin. D-biyotini, şerit başına% 1 insan serum albümini içeren 3 mililitre HEPES tamponlu salin ile hazneden yıkayın. Hücreler istenen konsantrasyonda yeniden süspanse edildikten sonra, her şeride 100 mikrolitre ekleyin. Odayı 30 ila 60 dakika boyunca 37 santigrat derece,% 5 karbondioksit inkübatörüne yerleştirin.

Bu inkübasyon süresinden sonra, hücreleri oda sıcaklığında 10 ila 20 dakika boyunca% 4 paraformaldehit ile sabitleyin. Paraformaldehiti çıkarmak için her şeritten 3 mililitre fosfat tamponlu salin geçirerek yıkayın. Ardından, oda sıcaklığında 30 dakika inkübe etmeden önce 400 mikrolitre bloke edici tampon ekleyin.

Daha sonra, 200 mikrolitre seyreltilmiş, floresan etiketli phalloidin ve floresan etiketli anti-perforin monoklonal antikor ekleyerek F-aktin ve perforini boyayın. Hazneden 3 mililitre fosfat tamponlu tuzlu su geçirerek yıkamadan önce oda sıcaklığında bir saat inkübe edin. Hazne görüntüleme için hazırdır.

Başlamak için, STED mikroskobunun gerekli tüm donanım modüllerini açın. Görüntü analizi yazılımını başlatın ve hem rezonans tarama hem de STED modüllerini etkinleştirin. Bu seçimleri yaptıktan sonra, yazılımın başlaması için yaklaşık üç ila beş dakika bekleyin.

Ekranın üst kısmındaki Yapılandırma sekmesine tıklayın. Lazer Yapılandırması'nı seçin. Ardından beyaz ışığı ve STED 592 nanometre lazerleri açın. 100X objektifi seçin ve uyarma lazer ışınını 592 nanometre tükenme lazeriyle hizalayın. Lazer Yapılandırma modülünü seçin. 592 tükenme lazerini kapatın ve 660 nanometre tükenme lazerini açın.

Slaytı lensin üzerindeki sahneye yerleştirin. Beyaz ışık lambasını ve oküler kullanarak sınırları belirlenmiş iki katmanlı bölgeye bağlı hücreleri odak noktasına getirin. Ardından, doğrudan Yapılandırma sekmesinin sağındaki Alma sekmesine dönün. Beyaz Işığa Geç sekmesine tıklayın ve ardından bu modülü açın ve uyarma lazer çizgisini uygun dalga boyuna sürükleyin.

İstenen dedektörü seçtikten ve algılama aralığını ayarladıktan sonra, sol taraftaki araç çubuğunun altındaki sıralı tarama iletişim kutusunu açmak için sol taraftaki Al araç çubuğundaki Sıralı düğmesine tıklayın. Bu, kullanıcının her biri farklı bir renk için farklı bir uyarma ışınına sahip birden fazla dizi eklemesine olanak tanır. Çerçeveler arasında tıklatın ve ardından her ek renk için uyarma frekansını, algılayıcıyı ve algılama aralığını ayarlayın. Tüm ayarlar optimize edildikten sonra, satın alma sürecini başlatmak için Başlat'a basın.