JoVE Encyclopedia of Experiments
İmmünoloji
0 görüntüleme • 4:26 dk • July 8th, 2025
Rezeke edilmiş bir insan akciğeri ile başlayın.
Akciğerin ana bronşuna silikon bir tüp yerleştirin. Tüpü sabitleyin, sonraki adımlarda agarozun dokuya sokulması için bir yol sağlayın.
Doldurma sırasında agaroz sızıntısını önlemek için diğer bronşları ve damarları sıkıştırın.
Tamamen şişene kadar besiyeri ile karıştırılmış önceden ısıtılmış düşük jelleşen agarozu akciğere verin.
Agaroz polimerizasyonu için akciğeri buzun üzerine yerleştirin, dokuya stabilite sağlayan ve kesit prosedürleri sırasında akciğer mimarisini koruyan katı bir jel matrisi oluşturun.
Polimerizasyondan sonra, akciğer dokusunu düzgün plakalar halinde kesin. Doku plakalarından silindirik doku çekirdeklerini çıkarın.
Soğutulmuş tamponla doldurulmuş bir doku dilimleyici kullanarak, hassas kesilmiş akciğer dilimleri elde etmek için doku çekirdeğini dilimleyin.
Dilimleri soğutulmuş ortam içeren bir kültür plakasına aktarın. Dokuyu stabilize etmek için inkübe edin.
Son olarak, dilimleri ortam içeren çok kuyulu bir plakaya aktarın. Hazırlanan hassas kesilmiş akciğer dilimleri artık deneyler için hazırdır.
Bu işleme başlamak için, silikon tüpü yerleştirerek ve tüpe paralel bir kelepçe ile sabitleyerek trakeayı kanüle edin, böylece kelepçe dokuyu silikon tüpün yanında sıkıştırmadan sıkıştırır. Diğer tüm bronşları, kan damarlarını ve yaralanmaları klemplerle kapatın, böylece dolgu işlemi sırasında agaroz dışarı sızmaz.
Ana bronşu kanüle etmek için iyi anatomik becerilere ihtiyaç vardır. Akciğerler çok fazla genişletilmemelidir aksi takdirde doku dikkati dağıtır ve doku yeterince dolu değilse doku çok yumuşak olduğu için herhangi bir PCLS yapmak imkansız hale gelir.
Daha sonra, eşdeğer hacimde% 3 düşük jelleşen agarozu bir beherde kültür ortamı ile karıştırın ve karışımı 50 mililitrelik bir şırınga kullanarak akciğere dayıltın. Şırıngayı orta ile yeniden doldurmadan önce, hava kabarcıklarını ve agaroz içermeyen akıyı önlemek için kateteri parmaklarınızla veya bir kelepçeyle kelepçeleyin. Akciğer dokusunu 3 ila 5 santimetrelik plakalar halinde kesin.
Kağıt mendil dilimleyiciyi 400 mililitre buz gibi EBSS ile doldurun. Hemen, bir karot aleti ile yarı otomatik bir tornavida kullanarak silindirik doku çekirdeklerini akciğer plakalarından kesin. Daha sonra, doku çekirdeklerini doku dilimleyicinin doku tutucusuna aktarın. Ağırlığı doku çekirdeğinin üzerine yerleştirin ve doku çekirdeğini PCLS'ye dilimlemeye başlayın. Ortam, cam silindirin kelepçesi açılarak doku dilimleyiciden bir behere boşaltılmalıdır.
Daha sonra, dilimleri bir beherden kültür ortamı ile Petri kabına aktarın. Bunu takiben, Petri kabını bir inkübatöre yerleştirin ve yıkama adımlarından önce ortamın ısınmasına izin verin. Daha sonra, akciğer dilimlerini, oyuk başına iki dilim için en az 500 mikrolitre kültür ortamı içeren 24 oyuklu bir kültür plakasına dikkatlice aktarın.