JoVE Deneyler Ansiklopedisi
İmmünoloji
0 görüntülenme • 3:34 dk. • July 8th, 2025
Mast hücreleri içeren odacıklı bir kapak camı alın - salgı granülleri olan bağışıklık hücreleri veya enflamatuar mediatörler içeren SG'ler.
PH'a duyarlı bir floresan raportör ile birlikte IgE antikorları ekleyin ve inkübe edin.
Antikorlar, mast hücreleri üzerindeki Fc reseptörlerine bağlanır. Muhabirler pinositoz yoluyla içselleştirilir ve ortaya çıkan endozomlar SG'lerle birleşir.
Ortamı çıkarın. Birden fazla IgE bağlayıcı epitop içeren bir antijen ekleyin; Slaytı bir floresan mikroskobu altına yerleştirin ve gerekli uyarma dalga boyunu uygulayın.
SG'lerin asidik pH'ı, muhabir floresansını söndürür.
Antijen, hücre yüzeyindeki IgE reseptör komplekslerine bağlanır ve onları çapraz bağlar.
Antijen aracılı reseptör agregasyonu, SG'lerin plazma zarına doğru göç etmesini tetikler.
Plazma ve SG zarı üzerindeki SNARE proteinleri, ekzositoz olarak adlandırılan zar füzyonuna ve SG yükünün boşaltılmasına aracılık eder.
Ortamın daha yüksek pH'ı, SG alkaliizasyonuna neden olarak raportörlerin floresanı yeniden kazanmasına neden olur.
Gelen SG'ler membranla kaynaşmış olanlarla birleşir. İkinci SG'nin alkalizasyonu, bileşik ekzositozu doğrulayarak floresan geri kazanımına aracılık eder.
Taze FITC-dekstran takviyeli kültür ortamı ile odacıklı bir kapak camına 10 mikrolitre hücre süspansiyonu ekleyin ve RBL hücrelerini gece boyunca büyütün. İlk olarak, metin protokolüne göre son bir Tyrode tampon çözeltisi hazırlayın. Ardından, yeni yapılmış tamponda 20x bir sekretagog reaktifi hazırlayın.
400 milimoluk bir amonyum klorür çözeltisi oluşturmak için amonyum klorür tozunu Tyrode'un tamponunda çözün. Ardından, medyayı odacıklı kapak camından aspire edin ve 300 mikrolitre önceden ısıtılmış Tyrode tamponu ile değiştirin. Yıkama işlemini iki kez tekrarladıktan sonra, hazneyi 300 mikrolitre Tyrode tamponu ile doldurun.
Ardından, odacıklı kapak camını bir mikroskobun inkübatör odasına yerleştirin ve haznenin sabit olduğundan emin olun. Floresan ışık kaynağını açın ve uygun floresan filtresini seçin. İlgilenilen bölge görüş alanının ortasında netlendiğinde, ışık kaynağını kapatın.
Ardından, 500 ila 550 nanometre civarında toplanan emisyonla 488 nanometre lazeri açın. Ardından, görüntü alımları arasındaki zaman aralığını kalibre edin. Tarama yönünü "Çift yönlü" olarak ayarlayın. Ortalamaya izin vermeyin. İğne deliğini açın ve çözünürlüğü 512 x 512 olarak ayarlayın.
Ardından, hücreleri belirli hücre tipi veya sekretagog için uygun süre boyunca görüntüleyin. Daha sonra sekretagog solüsyonundan hazneye 16 mikrolitre ekleyin ve çekime devam edin. Son olarak, FITC-dekstran'ın salgı granüllerine varlığını ve lokalizasyonunu doğrulamak için, odaya yavaşça 16 mikrolitre amonyum klorür çözeltisi ekleyin.