JoVE Encyclopedia of Experiments
İmmünoloji
0 görüntüleme • 2:49 dk • July 8th, 2025
Uygun gözenek boyutuna sahip dikey rejenere selüloz membranlar içeren büyük hacimli bir santrifüj filtre cihazı alın.
Tampon ve santrifüj ekleyin. Akış içeren membran nemlendiricisini çıkarın.
Cihazı, çözünür proteinleri ve hücre dışı vezikülleri veya bakteriler tarafından salgılanan biyomolekülleri içeren nano boyutlu lipide bağlı yapıları kapsayan bakteri kültürü süzüntü proteini veya CFP ile yükleyin.
Santrifüjleme sırasında CFP, merkezkaç kuvveti ile membranlardan teğetsel olarak geçer.
Zarın gözeneklerinden daha küçük biyomoleküller kültür sıvısı ile geçerken, EV'ler gibi daha büyük moleküller zar yüzeyinden geçerek zar tıkanmasını en aza indirir.
Filtre, biyomolekül kurumasını önlemek için ölü durdurma hacminin yardımıyla CFP'yi minimum cihaz hacmine konsantre eder.
Tampon ve santrifüj ekleyin.
Tampon, artık ortam bileşenlerinin yerini alarak CFP biyomolekülleri için izotonik bir ortam yaratır ve bütünlüklerini korur.
Konsantre kabını filtre kabının üzerine yerleştirin, ters çevirin ve santrifüjleyin. Daha fazla analiz için konsantre CFP retentatını geri kazanın.
Başlamak için, PBS'nin tam hacim kapasitesini ekleyerek 100 kilodalton moleküler ağırlık kesme santrifüj filtresi hazırlayın. 4 santigrat derecede 2.800 kez g'de beş dakika santrifüjleyin. İçindeki akışı ve kalan PBS'yi atın ve numune odasını maksimum kapasitesine kadar Mtb CFP ile doldurun. Hacim ultrafiltrasyon cihazının minimum hacmine düşene kadar 4 santigrat derecede 2.800 kez g'de santrifüjleyin. Numunenin tamamı yeterince azaltılana kadar gerektiği kadar tekrarlayın.
Konsantreyi içeren filtre ünitesine toplam cihaz kapasitesine kadar 1x PBS ekleyin. Hacmi daha önce açıklandığı gibi azaltın ve tam yıkama ve tampon değişimini sağlamak için bu adımı beş kez tekrarlayın. Ardından, ultrafiltrasyon cihazı özelliklerine göre 100 kilodalton konsantre CFP retentatını veya 100R'yi geri kazanın. Filtreyi en az 1x PBS hacminde en az üç kez yıkayın ve geri kazanımı en üst düzeye çıkarmak için yıkamayı 100R ile çekin.
Bu makale, büyük hacimli bir santrifüj filtreleme cihazı kullanarak bakteriyel kültür filtratı proteinlerinin (CFP) konsantre edilmesi yöntemini açıklamaktadır. Süreç, biyomoleküllerin boyuta göre ayrılması için santrifüjasyon içererek hücre dışı veziküllerin (EV'ler) ve çözünür proteinlerin geri kazanımına olanak tanır.
Ekstraselüler veziküller de dahil olmak üzere bakteriyel kültür filtratı proteinlerinin verimli bir şekilde konsantre edilmesi, güçlü biyobelirteç keşfine ve alt aşama translasyonel araştırmaların gerçekleştirilmesine olanak sağlamak açısından kritiktir. Ultrafiltrasyon tabanlı iş akışları, enfeksiyone hastalık portföylerinde yüksek güvenilirlikli hedef doğrulaması ve assay geliştirme için gerekli olan tekrarlanabilir örnek hazırlama süreçlerini destekler. Bu yetenek, erken aşamadaki biyolojik içgörülerin güvenilirliğini artırır ve keşif hattı boyunca riskten arındırılmış ilerlemeyi kolaylaştırır.
Bu ultrafiltrasyon protokolü, erken keşif ve analiz geliştirme arayüzünde yer alarak hem mekanistik çalışmalar hem de translasyonel araştırmalar için konsantre, yüksek bütünlüğe sahip örnekler sağlar.
İlgili videolar
0 Görüntüler
İlgili videolar
0 Görüntüler
İlgili videolar
0 Görüntüler
İlgili videolar
0 Görüntüler
İlgili videolar
0 Görüntüler
İlgili videolar
0 Görüntüler
İlgili videolar
0 Görüntüler
İlgili videolar
0 Görüntüler
İlgili videolar
0 Görüntüler
İlgili videolar
0 Görüntüler
Son güncelleme: 29 Ağustos 2026