Bakteri Kültürü Bir Ultrafiltrasyon Cihazı Kullanarak Protein Konsantrasyonunu Süzün.

Uygun gözenek boyutuna sahip dikey rejenere selüloz membranlar içeren büyük hacimli bir santrifüj filtre cihazı alın.

Tampon ve santrifüj ekleyin. Akış içeren membran nemlendiricisini çıkarın.

Cihazı, çözünür proteinleri ve hücre dışı vezikülleri veya bakteriler tarafından salgılanan biyomolekülleri içeren nano boyutlu lipide bağlı yapıları kapsayan bakteri kültürü süzüntü proteini veya CFP ile yükleyin.

Santrifüjleme sırasında CFP, merkezkaç kuvveti ile membranlardan teğetsel olarak geçer.

Zarın gözeneklerinden daha küçük biyomoleküller kültür sıvısı ile geçerken, EV'ler gibi daha büyük moleküller zar yüzeyinden geçerek zar tıkanmasını en aza indirir.

Filtre, biyomolekül kurumasını önlemek için ölü durdurma hacminin yardımıyla CFP'yi minimum cihaz hacmine konsantre eder.

Tampon ve santrifüj ekleyin.

Tampon, artık ortam bileşenlerinin yerini alarak CFP biyomolekülleri için izotonik bir ortam yaratır ve bütünlüklerini korur.

Konsantre kabını filtre kabının üzerine yerleştirin, ters çevirin ve santrifüjleyin. Daha fazla analiz için konsantre CFP retentatını geri kazanın.

Başlamak için, PBS'nin tam hacim kapasitesini ekleyerek 100 kilodalton moleküler ağırlık kesme santrifüj filtresi hazırlayın. 4 santigrat derecede 2.800 kez g'de beş dakika santrifüjleyin. İçindeki akışı ve kalan PBS'yi atın ve numune odasını maksimum kapasitesine kadar Mtb CFP ile doldurun. Hacim ultrafiltrasyon cihazının minimum hacmine düşene kadar 4 santigrat derecede 2.800 kez g'de santrifüjleyin. Numunenin tamamı yeterince azaltılana kadar gerektiği kadar tekrarlayın.

Konsantreyi içeren filtre ünitesine toplam cihaz kapasitesine kadar 1x PBS ekleyin. Hacmi daha önce açıklandığı gibi azaltın ve tam yıkama ve tampon değişimini sağlamak için bu adımı beş kez tekrarlayın. Ardından, ultrafiltrasyon cihazı özelliklerine göre 100 kilodalton konsantre CFP retentatını veya 100R'yi geri kazanın. Filtreyi en az 1x PBS hacminde en az üç kez yıkayın ve geri kazanımı en üst düzeye çıkarmak için yıkamayı 100R ile çekin.