JoVE Deneyler Ansiklopedisi
İmmünoloji
0 görüntülenme • 2:24 dk. • July 8th, 2025
Arka beyin ventrikülünde mantar sporları enjekte edilmiş bir zebra balığı larvasını ele alalım.
Makrofajlar, enjeksiyon bölgesine alınır ve sporların etrafında sıkı bir küme oluşturur.
Sporlar makrofajlar tarafından fagositik yutulmaya uğrar.
Bu sporlar, fagozom içindeki bozulmaya direnme yeteneğine sahiptir, bu da onların hiflere çimlenmelerine ve makrofajın nekrotik hücre ölümünü indüklemelerine izin verir.
Hifler, yüzeylerinde açıkta kalan patojenle ilişkili moleküler desenlere veya PAMP'lara sahiptir.
Enfeksiyon bölgesine alınan nötrofiller, PAMP'ları tanır ve bağlar. Nötrofillerle temas, hiflerde karmaşık bir hiper dallanma fenotipini tetikler, böylece nötrofiller tarafından yutulmalarını engeller ve bağışıklıktan kaçmayı kolaylaştırır.
Larvaları homojenize edin, canlı mantar sporlarını ve hifleri serbest bırakın. Hücresel kalıntıları gidermek için santrifüjleyin ve süpernatanı bir büyüme ortamı üzerine yerleştirin.
Kuluçka üzerine, mantar kolonisi oluşturan birimleri veya CFU'ları sayın.
CFU sayımları, konakçı bağışıklık savunmasından kaçan canlı mantar sporlarının sayısını temsil eder.
Enjeksiyondan hemen sonra, larvaların sekizini ayrı ayrı 1.7 mililitrelik tüplere aktarın ve ötenazi yapın. Ampisilin ve kanamisin ile 1 mililitre PBS hazırlayın. Larvaların bulunduğu tüplerden mümkün olduğunca fazla sıvı alın. Ardından, antibiyotikli 90 mikrolitre PBS ekleyin.
Larvaları 6 dakika boyunca dakikada 1.800 salınımda bir doku parçalayıcıda homojenize edin. Ardından, 30 saniye boyunca 17.000 kez g'de döndürün. Homojenize süspansiyonu her tüpten etiketli bir GMM plakasının ortasına pipetleyin ve kenara yayılmamasını önlemeye dikkat ederek tek kullanımlık L şeklinde bir yayıcı kullanarak yayın. Plakaları 2 ila 3 gün boyunca 37 santigrat derecede baş aşağı inkübe edin. Ardından, oluşan kolonilerin sayısını sayın.