JoVE Encyclopedia of Experiments
İmmünoloji
0 görüntüleme • 2:58 dk • July 8th, 2025
Hassas izleme için benzersiz floresan işaretleyicilerle etiketlenmiş floresan etiketli bağışıklık hücrelerini ifade eden transgenik zebra balığı larvaları ile başlayın.
Larvalar, arka beyinlerinde Aspergillus sporlarını ifade eden kırmızı floresan proteini ile önceden enjekte edilir.
Arka beyinde, mantar sporları lokal iltihabı taklit eder ve sporları açıklıkları için fagositoz yapan makrofajlar da dahil olmak üzere bağışıklık hücrelerini çeker.
Birkaç spor devam ederken ve hiflere çimlenirken, patojenden türetilmiş molekülleri serbest bırakır ve nötrofilleri enfeksiyon bölgesine çeker.
Anestezi uygulanmış bir larvayı, büyüme ve görüntüleme için zebra balığı yaralama ve tuzak cihazının veya bir kısıtlama kanalı aracılığıyla yaralama odasına bağlanan zWEDGI cihazının orta içeren yükleme odasına aktarın.
Arka beyin görüntüleme için larvaları dorsal-lateral oryantasyonda kısıtlama kanalı içinde sabitleyin.
Erken evrelerde, kırmızı floresan mantar sporlarını temsil ederken, yeşil floresan enfeksiyon bölgesine makrofaj alımını doğrular.
Zamanla, kırmızı floresanın yayılması enfeksiyonun ilerlemesini gösterirken, ek mavi floresanın ortaya çıkması nötrofil alımını gösterir.
Görüntüleme gününde, 100 mikromolar PTU ve E3-trikat içeren bir adet 3,5 milimetre petri kabı hazırlayın. Bir zWEDGI cihazının haznelerine E3-tricaine ekleyin ve haznelerden ve kısıtlama kanalından hava kabarcıklarını çıkarmak için bir P100 mikropipet kullanın, ardından haznelerin dışındaki tüm fazla E3-tricaine'i çıkarın.
Bir larvayı pipetleyin ve E3 PTU ile tabağa aktarın, ardından mümkün olduğunca az sıvı ile E3-triciane aktarın. 30 saniye sonra, anestezi uygulanmış larvaları yaralama ve tuzak cihazının yükleme odasına aktarın.
E3-trikaini yaralama odasından çıkarın ve larvaların kuyruğunu kısıtlama kanalına hareket ettirmek için yükleme odasına bırakın. Arka beynin ters çevrilmiş bir objektif lens ile görüntülenebilmesi için larvanın yan, sırt veya dorsolateral tarafına yerleştirildiğinden emin olun.
Larvaları konfokal bir mikroskopla görüntüledikten sonra, larvaları kısıtlama kanalından yükleme odasına itmek için E3-trikaini yara odasına bırakın. Larvaları toplayın ve E3-tricaine ile tabağa geri aktarın, ardından mümkün olduğunca az sıvı ile E3 PTU ile tabağa aktarın. PTU'da durulayın ve 48 oyuklu plakaya geri aktarın.