Böcek Pupalarında İnflamatuar Hücre Dinamiklerini Araştırmak için Fotokonversiyon Tekniği

Transgenik Drosophila pupa içeren, etiketli yaralı epitel taşıyan, hücre yüzeyi proteinleri yeşil floresan sergileyen cam tabanlı bir tabakla başlayın.

Pupaların bağışıklık hücreleri - veya hemositler, sitoplazmada fotokonvertibl yeşil floroforları ve çekirdekte kırmızı floresan proteinleri eksprese ederek hücre takibini kolaylaştırır.

Yaralı hücreler kemoatraktanları veya enflamatuar molekülleri serbest bırakarak hemositleri yaralı bölgeye çeker.

Konfokal mikroskopi, yeşil epitel hücreleri ile çevrili yaralı alanı ortaya çıkarır.

İyileşme sırasında, yaranın yakınında kırmızı çekirdekli yeşil hemositler, zar çıkıntılarını uzatır - filopodia ve lamellipodia ve yaralı bölgeye doğru göç eder.

Zamanla, kemoatraktan yayılırken, uzaktaki hemositler yaraya doğru göç ederek bir bağışıklık hücresi dalgası oluşturur.

Göçmen hemositlerin alt popülasyonunu 405 nanometre dalga boyu ile aydınlatın. Bu, hemositlerin fotokonvertibl floroforunu geri dönüşü olmayan bir şekilde yeşilden kırmızıya dönüştürür.

Bu fotokonvertif hemositler, yaralı epiteli onarır ve yara bölgesinden uzaklaşır, fotokonversiyon hemositleri fotokonversiyon olmayan hemositlerden ayırır ve inflamatuar hücre dinamiklerini aydınlatır.

Göz bebeği kanadı kenarlarını sardıktan sonra, cam tabanlı çanağı hızlandırılmış görüntüleme için hızlı bir şekilde uygun bir mikroskoba aktarın. Ardından, uygun görüntü yakalama yazılımını açın.

Yazılımda, uygun lazerleri açın ve piksel doygunluğu olmadan yeterli floresan sinyali elde etmek için güçlerini ve kazanç ofsetlerini ayarlayın. Genel olarak, %5 ila %20 aralığındaki mümkün olan en düşük lazer gücü, foto ağartmayı en aza indirmek için en iyi sonucu verir.

Yara onarımını araştırmak için düşük büyütme altında tüm göz bebeği kanadına odaklanın veya yüksek büyütme altında yaraya odaklanın. Hem onarıcı epiteli hem de enflamatuar hücre alımını yakalamak için, önce mikroskobu, kontrol panelindeki ince odak ayarını kullanarak bir z-yığını kaydedecek şekilde ayarlayın. Yaralı epitelden, göç eden hemositleri içeren altındaki hücre dışı boşluğa kadar tarayın.

Ardından, yazılımı her 3 mikronda bir veya daha da dar aralıklarla göz bebeği kanadından z dilimleri kaydedecek şekilde ayarlayın. Hızlandırılmış görüntüleme için, en az bir saat boyunca en az 30 saniyede bir z yığınlarını kaydedin.

Görüntüleme sırasında bir hücre alt kümesini seçici olarak foto dönüştürmek ve etiketlemek için foto dönüştürülebilir probları kullanırken, foto dönüştürmeyi gerçekleştirmek ve 405 nanometre lazeri etkinleştirmek için görüntüleme yazılımı içindeki uygun modülleri açın. Ardından, bir seçim aracı kullanarak FRAP yazılımı içinde fotoğrafa dönüştürülecek hücreleri seçin.

Ardından, fotoğraf dönüştürme için zaman rotasını tek bir yineleme karesine ayarlayın ve 405 nanometre lazeri %20 lazer gücüne ayarlayın, ardından fotoğraf dönüştürme gerçekleştirmek için Deneyi Başlat'ı tıklayın. Tamamlandığında, FRAP modülünden çıkın ve orijinal görüntüleme ekranına dönün. Orada, lazerleri kullanılan floroforlara ayarlayın ve hızlandırılmış kayıtlar kullanarak fotoğrafa dönüştürülmüş ve fotoğrafa dönüştürülmemiş hücreleri görüntüleyin.