Kapsüllenmiş Bakterilerin Anti-Kapsül Antikorları Tarafından Opsonizasyonunu Değerlendirmek için Bir Opso-Uyum Testi

Kimyasal olarak öldürülmüş, floresan olarak etiketlenmiş Bacillus anthracis'in bir süspansiyonunu alın.

Esas olarak poli-gama-glutamik asitten oluşan bakteri kapsülü, fagositoza karşı koruma sağlar.

Kompleman proteinlerini yok etmek için ısıyla inaktive edilmiş insan olmayan primat serumlarını ele alalım. Bakteriyel kapsül bazlı bir aşı ile aşılanmış hayvanlardan izole edilen bu serumlar, anti-kapsül antikorları içerir.

Kimyasal olarak öldürülmüş bakteri süspansiyonunu seruma ekleyin. Antikorlar spesifik olarak bakteri kapsüllerine bağlanır, bakteriyel opsonizasyonu kolaylaştırır ve bunları fagositik hücreler tarafından elimine edilmek üzere işaretler. Opsonizasyonu geliştirmek için standart kompleman proteinleri ekleyin.

Opsonize bakterileri yapışkan makrofajlara - fagositik hücrelere aktarın. Kısa bir süre kuluçkaya yatırın.

Bakteriler üzerindeki antikorlar ve kompleman proteinleri, sırasıyla makrofaj Fc reseptörlerine ve kompleman reseptörlerine bağlanarak bakteri aderansını teşvik eder.

Medyayı çıkarın. Yapışmamış bakterileri uzaklaştırmak için tampon ile yıkayın.

Hücresel bütünlüğü korumak için hücreleri sabitleyin.

Makrofajları etiketlemek için floresan bir leke kullanın.

Bir floresan mikroskobu kullanarak, farklı floresan makrofajlara yapışmış floresan bakterileri gözlemleyin ve anti-kapsül antikorları tarafından etkili bakteriyel opsonizasyonu doğrulayın.

Fiksatifi çıkarmak için inaktive edilmiş bakteri stoğunu PBS'de üç kez yıkayın. Mililitre başına 75 mikrogramlık bir nihai konsantrasyonda FITC çözeltisi ekleyin. Karışımı yavaş yavaş, dört santigrat derecede 18 ila 24 saat çalkalayın. Fazla FITC'yi çıkarmak için bakterileri daha önce olduğu gibi yıkayın.

Son yıkamadan sonra, basili PBS'de aynı başlangıç hacminde tekrar süspanse edin. Basili alikotlayın ve kullanana kadar -20 santigrat derecede saklayın. İnsan olmayan primatlardan alınan küçük hacimli test serumlarını 56 santigrat derecede 30 dakika boyunca, bir ısı bloğunda veya PCR makinesinde ısıyla etkisiz hale getirin. FITC etiketli bakterileri PBS ile iki kez çözün ve yıkayın, üç ila beş dakika boyunca 15.000 kez g'de peletleyin. PBS'de aynı başlangıç biriminde yeniden askıya alın.

96 oyuklu yuvarlak tabanlı bir plakada, test serumlarını hücre ortamında seri olarak seyreltin. Başka bir 96 oyuklu yuvarlak tabanlı plakada, her bir oyuğa 10 mikrolitre seyreltilmiş test serumu ekleyin. Ardından, 10 mikrolitre taze sulandırılmış bebek tavşan tamamlayıcısı ekleyin.

Üç numaralı plakaya, örneğin 50.000 hücre için 50.000 çarpı 20 basil içeren bir hacimde, 20'lik bir enfeksiyon çokluğu için uygun hacimde FITC etiketli basil ekleyin. Her bir oyuğu üç numaralı plakada, toplam 105 mikrolitreye kadar uygun hacimde hücre ortamı ile doldurun. Üç numaralı plakayı, basilleri opsonize etmek için nem ile% 5 CO2 varlığında 37 santigrat derecede 30 dakika inkübe edin.

Yapışık hücreler içeren bir numaralı plakayı 37 santigrat derecelik bir ısı bloğuna yerleştirin. Kullanılmış ortamı kuyulardan çıkarmak için çok kanallı bir pipetleyici kullanın ve pipetleme sırasında kuyucuklarda kabarcık oluşmamasını sağlamak için üç numaralı plakadan 100 mikrolitre opsonize bakteri ile hızlı bir şekilde değiştirin. Hücre tek tabakasını rahatsız etmemek için, kuyucukların kenarlarına hacim ekleyin.

Bir numaralı plakayı 37 santigrat derecede% 5 CO₂ ve nem ile yapışma için 30 dakika inkübe edin. Bağlanmamış basilleri çıkarmak için her kuyuyu 37 santigrat derece ısı bloğunun üzerine 150 mikrolitre PBS ile beş kez yıkayın. Hücrelerin yıkama sırasında yanlışlıkla dağılmamasını sağlamak için kuyucukların yan tarafına pipetleyin. Her oyuğa 150 mikrolitre% 4 paraformaldehit ekleyin ve hücreleri bir saat boyunca sabitleyin.

Hücreleri PBS ile iki kez yıkadıktan sonra, iki mikrolitre yüksek içerikli tarama turuncu hücre lekesini 10 mililitre PBS'de karıştırın. Daha sonra, bu boyama çözeltisinden 150 mikrolitre sabit hücrelere ekleyin ve ortam sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. Bir numaralı plakayı sahneye yerleştirin ve parlak alan veya faz kontrastı kullanarak hücrelere odaklanın.

Edinme sekmesinde, plaka ayarı olarak 96-Kuyucuk formatı'nı seçin ve ardından Kanal ayarları'nı seçin. Ardından, Döşeme Moduna Ayarla'yı seçin. Alınacak görüntü sayısını belirtin. Alım modunu siyah beyaz veya tek renkli olarak değiştirin ve gruplamayı en az 2'ye 2 olarak ayarlayın. Otomatik odaklama veya odaklama modülünü açın. Otomatik odaklama işlevinin ne sıklıkla gerçekleştirileceğini belirtin.

Ardından, varsa z-yığını işlevini açın, hücre tek tabakasının ve yapışık basillerin kalınlığını yakalayacak z-yığınlarının sayısını belirtin. Görüntülerin kaydedileceği bir dosya klasörü belirleyin. Şimdi, otomatik görüntüleme programını çalıştırın. Metin protokolünde açıklandığı gibi veri toplama ve analizi gerçekleştirin.