Fotoaktifleştirilebilir Peptit MHC ile Kontrollü T Hücre Aktivasyonunun Değerlendirilmesi

Biyotin açısından zengin bir yüzey oluşturmak için bir kapak camını biyotinile poli-L-lizin ile kaplayarak başlayın.

Daha sonra, biotin'e bağlanan ve sonraki etkileşimler için moleküler bir köprü oluşturan bir protein olan streptavidini tanıtın.

Daha sonra, yapışma molekülleri ile birlikte ana histouyumluluk komplekslerine - pMHC'lere bağlı biyotinile fotokafesli peptitler ekleyin.

Biyotinile pMHC ligandları ve adezyon molekülleri, streptavidin üzerindeki belirli bölgelerle etkileşime girerek immobilizasyonlarını sağlar.

Ardından, kapak camını tamponlanmış tuzlu su ile tekrar tekrar yıkayın ve T hücrelerini ekleyin.

Peptit üzerindeki belirli bir kalıntıya bağlı ışığa duyarlı bir kimyasal grup olan bir fotokafesin varlığı, T hücresi reseptörünün peptitle spontan bağlanmasını engeller.

Kontrollü T hücresi aktivasyonu için, fotokafesli peptitleri ultraviyole ışığa maruz bırakın.

UV ışığı, fotokafes-peptit kompleksi arasındaki kimyasal bağı kopararak peptitin doğal formunu açığa çıkarır.

T hücresi reseptörleri, maruz kalan peptitleri tanımlar ve bunlara bağlanırken, integrinler yapışma moleküllerine bağlanarak T hücresi aktivasyonunu tetikler.

Damıtılmış deiyonize su içinde 1 ila 500 oranında seyreltilmiş biyotinile poli-L-lizin veya biyo-PLL'yi 8 adet 8 kuyucuklu kapak camına ekleyerek başlayın. Oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. İnkübasyonun ardından, damıtılmış deiyonize su ile yıkayın ve ardından oda sıcaklığında iki saat kurutun.

Biyo-PLL kaplı yüzeyleri, oda sıcaklığında 30 dakika boyunca% 2 BSA ile HEPES tamponlu salinden oluşan bloke edici tampon ile bloke edin. İnkübasyonun ardından, kuyucukların kurumasına izin vermeden biyo-PLL kaplı yüzeylerden bloke edici tamponu çıkarın. Sonra streptavidin ekleyin ve 4 santigrat derecede inkübe edin.

Bir saat sonra, kaplanmış yüzeyleri HBS'de yıkayın. Hazne sürgülü kuyucukları 4 ila 5 kez doldurun ve ters çevirin, HBS'yi kuyulardan çıkarın. Kuyuların kurumasına izin vermeyin.

CD4 pozitif T hücreleri veya CD8 pozitif hücreler için spesifik biyotinile fotoaktif peptit majör histouyumluluk kompleksi ligandları ve adezyon moleküllerini biyo-PLL kaplı yüzeylere ekleyin. Işıktan koruyun ve oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin. Kuluçkadan sonra, daha önce olduğu gibi yıkayın ve tohumlamaya hazır olana kadar HBS'de bırakın. Son olarak, 200.000 CD4 pozitif veya CD8 pozitif T hücresi ekleyin, uygun TCR'yi doğru kuyucuklara eksprese edin ve hücrelerin 15 dakika boyunca 37 santigrat derecede yapışmasına izin verin.

Hücreler yüzeye yapıştıktan ve yayıldıktan sonra, fotoaktivasyon ve görüntüleme için hazırdırlar. Görüntü elde etmek için UV uyumlu 150x objektif lens ile donatılmış, ters çevrilmiş bir toplam yansıma floresan mikroskobu kullanın. Sırasıyla 488 nanometre ve 561 nanometre uyarma lazerleri kullanarak hem yeşil hem de kırmızı kanallardaki probları izleyin.

T hücrelerini içeren hazne sürgüsünü monte ettikten sonra, gerektiği gibi TIRF veya epifloresan aydınlatması elde etmek için mikroskop ayarlarını yapın. Canlı modda, ilgilenilen floresan probları ifade eden bir hücre alanı seçin. Yazılım kontrolünü kullanarak tek tek hücrelerin altında fotoaktivasyon için mikron ölçekli bölgeler oluşturun. Ardından, satın alma işlemini başlatın.

Tipik olarak, her biri arasında 5 saniyelik bir aralıkla 80 zaman noktası elde edilir. Bu, çift renkli deneyler durumunda sıralı 488 nanometre ve 563 nanometre pozlamaları için zaman bırakır. Ardından, 10 zaman noktası elde ettikten sonra, dijital diyafram deklanşörünü 1 ila 1,5 saniye açarak seçilen bölgeleri fotoğrafla etkinleştirin. Zaman atlamalı çekim tamamlandıktan sonra, yeni bir hücre alanı seçin ve işlemi tekrarlayın.