Antikor Biyodağılımını İncelemek için Bir İn Vivo İmmünofloresan Lokalizasyon Yöntemi

Meme kanserinin bir fare modelini ele alalım. Meme bezi tümörleri, kanser hücreleri, kanserle ilişkili fibroblastlar, adipositler, bağışıklık hücreleri ve tümör damar sistemini içerir.

Florofor konjuge tümöre özgü antikorları intravenöz olarak enjekte edin.

Tümör damar sistemine ulaştıktan sonra, antikorlar damar endotelyumu ve yakındaki kanser hücreleri üzerindeki tümöre özgü transmembran proteinlere bağlanır.

Meme bezini cerrahi olarak izole edin ve dondurucu bir ortama batırın.

Bir slayt üzerinde kriyo-kesitler elde edin ve donma ortamını çıkarmak için bir tampon ile durulayın.

Doku mimarisini korumak için bölümleri düzeltin. İmmün boyamayı geliştirmek için bir deterjan ve spesifik olmayan antikor bağlanmasını önlemek için bir bloke edici çözelti uygulayın.

Kan damarı endotel üzerindeki adezyon molekülleri için spesifik bir birincil antikor ve birincil antikora bağlanan ve vaskülatürü etiketleyen florofor konjuge bir ikincil antikor ekleyin.

Kızağa bir montaj ortamı ekleyin ve bir lamel yerleştirin.

Konfokal bir mikroskop altında, floresan olarak işaretlenmiş tümör damar sistemi içindeki ve çevresindeki tümöre özgü antikorların biyolojik dağılımını değerlendirin.

Metin protokolünde tarif edildiği gibi anesteziyi takiben, antikor solüsyonlarının kuyruk veni aşılaması için hazırlanın. Hayvanın kuyruğunu alkollü bir mendille üç kez silerek dezenfekte edin. Yaklaşık 30 saniye boyunca bir ısı yastığı ile ısıtarak kuyruk damarlarını genişletin; Tüm hayvanı ısıtmaktan kaçının. 27 gauge kuyruk kanadı kateteri kullanarak kelebek iğnesini iki yanal kuyruk damarından birine yerleştirin.

İğnenin düzgün bir şekilde yerleştirildiğinden emin olmak için katetere kan geri akışını görselleştirin, böylece solüsyonlar kuyrukta yakalanmak yerine hayvana tam olarak girecektir.

Kuyruğu yerleştirilen iğne ile sahneye dikkatlice sabitlemek için bir parça cerrahi bant kullanın. Kateteri 25 mikrolitre steril fosfat tamponlu salin ile yıkayın. Ardından, antikor solüsyonunu insülin şırıngaları kullanarak katetere enjekte edin. Kateteri bir kez daha 25 mikrolitre steril PBS ile yıkayın. İğneyi kuyruktan çıkarın ve herhangi bir kanamayı durdurmak için baskı uygulayın.

Metin protokolünde açıklandığı gibi farenin insancıl ötenazisini gerçekleştirin ve fareyi sırtüstü pozisyonda yatırın. Tümör dokularını çıkarmak için cerrahi makas ve forseps kullanın. Kuyruğa en yakın meme bezleri seti arasındaki derinin yalnızca dış tabakasını kavramak ve bir çift cerrahi makasla küçük bir kesi yapmak için forseps kullanın. Kapalı makası kesiğe sokun ve cildi alttaki karın duvarı zarından dikkatlice ayırmak ve sağlam tutmak için ucu yavaşça açın.

Cildi iç zardan ayırmaya devam ederek karın boyunca dikey bir kesi yapın. Üçüncü ve dördüncü meme bezleri arasında, cildin geri çekilmesine ve meme bezlerinin görüntülenmesine izin vermek için karın boyunca yatay bir kesim yapın. Her bir tümörü veya normal bezi forseps ile kavrayarak, bağlı cildi cerrahi makas kullanarak dikkatlice kesin.

Eksize edilen dokuları, önceden etiketlenmiş ve optimum kesme sıcaklığı gömme ortamı ile doldurulmuş tek kullanımlık doku taban kalıplarına yerleştirin. Kalıpları kuru buz üzerine yerleştirerek hızlı bir şekilde dondurun. Hedef dışı teslimatı incelemek için, ilgilenilen diğer dokuları veya organları çıkarın. Bir kriyostat kullanarak, donmuş doku bloklarını 10 mikron kalınlığında bölümlere ayırın ve bitişik bölümleri önceden etiketlenmiş yapışma cam slaytlarına yerleştirin.

Gömme ortamını çıkarmak için donmuş doku slaytlarını oda sıcaklığında PBS ile 5 dakika durulayın. Boyama sırasında ihtiyaç duyulan çözeltilerin hacmini azaltmak için doku bölümlerini hidrofobik bir bariyer kalemle ayırın. Doku bölümlerini 5 dakika boyunca% 4 paraformaldehit çözeltisi ile sabitleyin. Slaytları PBS'de 5 dakika duruladıktan sonra, doku kesitlerini PBS'de% 0.5 Triton X-100 ile 15 dakika boyunca geçirgen hale getirin. Slaytları PBS'de tekrar 5 dakika durulayın.

sıcaklığında 1 saat boyunca hacim başına %3 ağırlık, sığır serumu, albümin ve hacim başına %5 hacim keçi serumu içeren PBS ile dokuları bloke edin. Slaytları PBS'de 5 dakika duruladıktan sonra, bölümleri ortak bir nükleer, vasküler veya sitoplazmik belirteç gibi kayıt tutan birincil antikorlarla inkübe edin. Burada, sıçan anti-fare CD31, bloke etme çözeltisinde 1 ila 100 seyreltmede kullanılır. Primer antikorlu slaytlar, bir slayt tepsisi üzerinde dehidrasyondan korunarak gece boyunca 4 santigrat derecede bırakılır.

İnkübasyondan sonra, slaytları PBS'de üç kez 5 dakika durulayın. PBS'yi her seferinde değiştirin. Birincil antikorları etiketlemek için slaytları ikincil antikorlarla inkübe edin. Bu uygulama için, AlexaFluor-546 konjuge keçi anti-tavşan antikoru kullanarak anti-B7-H3 antikorunu görselleştirin ve CD31'i AlexaFluor-488 keçi anti-sıçan ikincil antikoru ile bloke edici çözeltide görselleştirin. Slaytları oda sıcaklığında 1 saat boyunca bir slayt tepsisinde ışıktan ve dehidrasyondan koruyun.

Slaytları PBS'de duruladıktan sonra, daha önce olduğu gibi, montaj ortamının bir damlasını doku diliminin ortasına uygulayın. Hava kabarcıklarının sıkışmasını önleyerek dikkatlice bir lamel yerleştirin. Lamelin kenarlarını şeffaf oje ile kapatın ve kurumasını bekleyin. Metin protokolünde açıklandığı gibi konfokal mikroskopi görüntüleme ve kantitatif görüntü analizi ile devam edin.