JoVE Encyclopedia of Experiments
İmmünoloji
0 görüntüleme • 4:34 dk • July 8th, 2025
Lameller üzerine yapışan osteosarkom hücreleri içeren çok kuyulu bir plaka alın.
Bu kemik kanseri hücreleri, strese neden olan bir kimyasalla önceden işlenir ve bu da stres granül oluşumuna neden olur.
Stres granülleri, translasyon yapmayan mRNA'ları, küçük ribozomal alt birimleri, RNA bağlayıcı proteinleri veya RBP'leri, translasyonla ilgili faktörleri ve sinyal proteinlerini içeren sitoplazmik membransız organellerdir.
Ortamı atın ve hücreleri tamponla yıkayın. Hücresel morfolojiyi korumak için hücreleri sabitleyin.
Hücre içi hedeflere erişmek için hücreleri geçirgen hale getirin. Spesifik olmayan antikor bağlanmasını önlemek için bloke edici proteinler ekleyin.
Stres granülleri içindeki spesifik RBP'lere ve translasyonla ilgili faktörlere bağlanan birincil antikorları tanıtın.
Farklı florofor etiketli ikincil antikorlar ve Hoechst boyası ile inkübe edin.
İkincil antikorlar, stres granülü ile ilişkili proteinlere bağlı birincil antikorlara bağlanırken, Hoechst molekülleri DNA'yı boyar.
Montaj ortamını kullanarak hücre içeren lameller monte edin.
Bir floresan mikroskobu kullanarak, ilişkili proteinlerin birlikte lokalizasyonu ile karakterize edilen floresan odaklar olarak görünen stres granüllerini görselleştirmek ve ölçmek için hücreleri gözlemleyin.
Hücreleri sabitlemek için, ortamı kuyulardan çıkarın ve hücreleri yaklaşık 250 mikrolitre PBS ile yıkayın. Hücreleri sabitlemek için yaklaşık 250 mikrolitre tamponlu% 4 paraformaldehit çözeltisi ekleyin ve lamel üst kısmının tamamen kaplandığından emin olun. Ardından, plakayı oda sıcaklığında 15 dakika boyunca bir tezgah külbütörü üzerinde bırakın. Ardından, paraformaldehiti çıkarın ve uygun şekilde atın.
Hücrelere nüfuz etmek ve düzleştirmek için yaklaşık 250 mikrolitre buz gibi soğuk metanol ekleyin. Plakayı bir külbütör üzerinde oda sıcaklığında 5 dakika daha inkübe edin. Geçirgenlik tamamlandıktan sonra, metanolü atın ve oda sıcaklığında 1 saat boyunca yaklaşık 250 mikrolitre bir bloke edici tampon uygulayarak hücreleri bloke edin. Daha sonra, 3 mililitre bloke edici tampona G3BP1, eIF4G ve eIF3b'ye karşı 12 mikrolitre antikor ekleyerek birincil antikor çözeltisini hazırlayın.
24 oyuklu plakanın her bir oyuğuna 250 mikrolitre antikor çözeltisi ekleyin. Plakayı oda sıcaklığında en az 1 saat boyunca bir külbütör üzerinde inkübe edin. 1 saatlik inkübasyondan sonra, antikor çözeltisini çıkarın ve hücreleri yaklaşık 250 mikrolitre PBS ile 5 dakika boyunca yıkayın. Daha sonra, ikincil antikor çözeltisini hazırlamak için 3 mililitre bloke edici tampona 3 mikrolitre Hoechst boyası ile birlikte 12 mikrolitre anti-fare Cy2, anti-tavşan Cy3 ve anti-keçi Cy5 antikorları ekleyin.
Her oyuğa 250 mikrolitre ikincil antikor çözeltisi ekleyin ve örnekleri ışıktan korumak için plakayı kapatın. Plakayı oda sıcaklığında 1 saat boyunca bir külbütör üzerinde inkübe edin. İnkübasyon tamamlandığında, antikor çözeltisini çıkarın ve hücreleri 5 dakika boyunca PBS ile yıkayın. Viskoziteyi azaltmak için montaj ortamını 37 santigrat derece ısı bloğunda 10 dakika ısıtın. Ardından, önceden kesilmiş 200 mikrolitrelik bir pipet ucu kullanarak, 25 mikrolitre montaj ortamını etiketli bir cam slayt üzerine yerleştirin.
İnce forsepslerle, lameli kuyudan slayta aktarın, üst kısmı hücreler montaj ortamına bakacak şekilde ters çevirin. Lameli aşağı bastırmak için temiz bir P200 ucu kullanın. Tüm lameller monte edildikten sonra, bir laboratuvar mendilini sürgüye sıkıca bastırarak fazla montaj ortamını çıkarın. Daha sonra, slaytı suyla yıkayın ve hemen bir kez daha laboratuvar dokusuyla kurulayın.