İnsan Mukozal Astar Sıvısında İmmün Mediatör Seviyelerinin Miktar Tayini

Numunenin bozulmasını önlemek için emilen nazal mukozal astar sıvısını içeren filtre kağıtlarını buz üzerinde çözdürün.

Sıvı, kemokinler ve sitokinler dahil olmak üzere bağışıklık aracılarını içerir.

Filtre kağıtlarını bir tampona daldırın. İçeriği tüp filtrelere aktarın. Mukozal astar sıvısını filtre kağıdından çıkarmak için santrifüjleyin.

Filtrelenmiş burun ekstraktını, bir dizi mediatöre özgü yakalama antikoru ile desenlenmiş test plakasına ekleyin.

İmmün mediatörler, karşılık gelen antikorlarına bağlanır.

İlgili aracılarına bağlanan bir rutenyum kompleksi ile etiketlenmiş tespit antikorlarını tanıtın.

Tripropilamin veya TPA içeren tris bazlı tampon ekleyin.

Elektrotlar boyunca bir potansiyel uygulandığında, rutenyum kompleksi ve TPA oksidasyona uğrar.

Ortaya çıkan TPA radikali rutenyum kompleksini heyecanlandırır.

Temel durumuna döndükten sonra, rutenyum kompleksi fotonlar yayar.

Ölçülen ışık yoğunluğu, mukozal astar sıvısındaki spesifik immün mediatör konsantrasyonu ile orantılıdır.

Hava yolu bağışıklık aracısı miktar tayini için, negatif 80 santigrat derece depolamadan 10 adede kadar numuneyi buz üzerine yerleştirin ve kimlik numaralarını kaydedin. Numuneler çözüldüğünde, her denek için her iki filtre kağıdını da filtre kağıdı başına 150 mikrolitre taze hazırlanmış tampona daldırın.

25 mililitre tampon stok çözeltisi başına bir tam proteaz inhibitör tableti ile destekleyin. Numuneleri 5 dakika boyunca 400 RPM'de bir plaka çalkalayıcıya aktarın. Tamponu ve filtre kağıtlarını ayrı ayrı selüloz asetat tüp filtrelerin kaplarına aktarın.

Mikrosantrifüj tüplerinin altındaki filtrelenmiş burun ekstraktını toplamak için numuneleri santrifüjleyin. Ardından bardakları çıkarın ve tüpleri buzun üzerine yerleştirin. Daha sonra, burun ekstraktının 150 mikrolitrelik alikotlarını düşük protein bağlayıcı saklama plakalarının ayrı ayrı kuyucuklarına aktarın ve plakaları analize kadar eksi 80 santigrat derecede saklayın. Daha sonra, standart tahlil protokollerine göre yüksek hassasiyetli elektrokemilüminesans tabanlı çoğullanmış dizi ile ilgilenilen nazal immün mediyatörlerin konsantrasyonunu ölçün.