JoVE Deneyler Ansiklopedisi
İmmünoloji
0 görüntülenme • 2:42 dk. • July 8th, 2025
Transmembran spike proteinlerine sahip zarflı virüsler, bir proteolitik bölünme bölgesi içerir.
Konakçı hücreler üzerindeki zara bağlı proteazlar, spike proteinlerini parçalayarak virüs girişini kolaylaştıran füzyon peptitlerini açığa çıkarır.
Başlamak için, kanonik bölünme bölgesi ve varyant peptitleri olan vahşi tip peptitleri alın, her biri bölgede benzersiz bir mutasyon taşır.
Florojenik peptitler bir florofor ve bir söndürücü içerir. Yakınlık nedeniyle, söndürücü floroforun floresansını emer.
Buz üzerinde tahlil tamponu ve konakçı proteazlar içeren çok kuyulu bir plaka alın.
Vahşi tip ve varyant peptitleri ayrı kuyucuklara ekleyin. Optimum proteaz aktivitesi için uygun bir sıcaklıkta inkübe edin.
Proteaz, peptitleri parçalayarak söndürücüyü florofordan ayırır ve floresan emisyonunu sağlar.
Proteolitik bölünme oranını belirlemek için floresan sinyalindeki değişikliği ölçün.
Yabani tip dizi için daha yüksek bir oran, daha yüksek proteolitik aktiviteyi gösterirken, varyantlar için daha düşük bir oran, değişmiş bölünme verimliliğini gösterir.
Metin protokolünde açıklandığı gibi proteazlar için uygun tahlil tamponlarını hazırlayın ve tamponları buz üzerinde soğutun. Soğutma ve stabiliteyi desteklemek için altında ince bir metal plaka bulunan buzun üzerine katı siyah polistiren, işlenmemiş düz tabanlı 96 oyuklu bir plaka yerleştirin.
Bitişik kuyucuklardan floresan sızıntısını önlemek için tahlil plakası olarak Siyah bir plaka kullanmak önemlidir.
Peptit başına, numune başına toplam 100 mikrolitre hacimde tahlil başına üç teknik kopya hazırlayın. Tahlil plakasının her bir oyuğuna uygun miktarda tahlil tamponu pipetleyin. Her kuyucuğa 0,5 mikrolitre proteaz ekleyin. Altı kuyucuğa, ilgili proteaz yerine 0,5 mikrolitre tampon ekleyin. Bunlardan üçü boş kontroller ve diğer üçü peptit kontrolleri olacaktır.
Boş kontroller hariç, her bir oyuğa 50 mikromolar nihai konsantrasyona 5 mikrolitre peptit ekleyin. Üç boş kontrol kuyusunun her birine, peptit yerine 5 mikrolitre tampon ekleyin. Plakayı floresan plaka okuyucusuna yerleştirin ve Başlat'a tıklayın.