Proteazların proteolitik aktivitesini taramak için bir florojenik peptit bölünme testi

Transmembran spike proteinlerine sahip zarflı virüsler, bir proteolitik bölünme bölgesi içerir.

Konakçı hücreler üzerindeki zara bağlı proteazlar, spike proteinlerini parçalayarak virüs girişini kolaylaştıran füzyon peptitlerini açığa çıkarır.

Başlamak için, kanonik bölünme bölgesi ve varyant peptitleri olan vahşi tip peptitleri alın, her biri bölgede benzersiz bir mutasyon taşır.

Florojenik peptitler bir florofor ve bir söndürücü içerir. Yakınlık nedeniyle, söndürücü floroforun floresansını emer.

Buz üzerinde tahlil tamponu ve konakçı proteazlar içeren çok kuyulu bir plaka alın.

Vahşi tip ve varyant peptitleri ayrı kuyucuklara ekleyin. Optimum proteaz aktivitesi için uygun bir sıcaklıkta inkübe edin.

Proteaz, peptitleri parçalayarak söndürücüyü florofordan ayırır ve floresan emisyonunu sağlar.

Proteolitik bölünme oranını belirlemek için floresan sinyalindeki değişikliği ölçün.

Yabani tip dizi için daha yüksek bir oran, daha yüksek proteolitik aktiviteyi gösterirken, varyantlar için daha düşük bir oran, değişmiş bölünme verimliliğini gösterir.

Metin protokolünde açıklandığı gibi proteazlar için uygun tahlil tamponlarını hazırlayın ve tamponları buz üzerinde soğutun. Soğutma ve stab