Parazitle Enfekte Eritrositlerin Antikor Aracılı Fagositozunun Ölçülmesi İçin Bir Test

Plasmodium falciparum ile enfekte olmuş eritrositleri alın. Parazit görselleştirmesi için parazit DNA'sını bir floresan boya ile etiketleyin.

Bu parazitle enfekte olmuş eritrositleri sıtmaya maruz kalan bireylerden alınan serumlarla inkübe edin. Bu hücreler, yüzeylerinde parazit antijenleri gösterir, bu da serumlarda doğal olarak edinilmiş insan IgG antikorlarına bağlanır ve fagositoz için hücreleri opsonize eder.

Opsonize parazitle enfekte olmuş eritrositleri, insan kaynaklı monositlerin veya fagositik hücrelerin bir süspansiyonunu içeren protein kaplı çok kuyulu bir plakaya aktarın.

İnkübasyon sırasında, monositler üzerindeki Fc-gama reseptörleri, IgG-opsonize eritrositlerle etkileşime girerek eritrositlerin fagozomlara yutulmasını tetikler.

Kuluçka sonrası, daha fazla hücresel etkileşimi önlemek ve fagositozu durdurmak için plakayı santrifüjleyin.

Süpernatanı atın. Amonyum klorür parçalama çözeltisi ile muamele edin, fagosite uğramamış enfekte eritositleri monositleri etkilemeden seçici olarak yırtın.

Parçalama işlemini durdurmak için serum içeren tampon ekleyin. Parçalanmış eritrositler içeren süpernatanı santrifüjleyin ve atın.

Monositleri bir tampon içinde yeniden süspanse edin.

İçlerindeki parazitle enfekte eritrositlerden floresan gösteren monositleri ölçmek için akış sitometrisi yapın ve antikor aracılı fagositozlarını doğrulayın.

Saflaştırılmış enfekte eritrosit süspansiyonunu, etidyum bromür içeren parazit kültürü ortamında mililitre başına 10 ila 7. hücreler arasında mililitre başına 2.5 mikrogramlık bir nihai konsantrasyona ayarlayın. Daha sonra, plakayı bir atık kabına iterek 96 oyuklu bir plakadan bloke etme solüsyonunu çıkarın. Daha sonra, bir kağıt havlu üzerindeki fazlalığı alın ve plakanın üst yarısındaki bir kuyucuğun tümüne 30 mikrolitre etidyum bromür etiketi ile enfekte olmuş eritrosit süspansiyonu ekleyin. Boş kuyucuğa 30 mikrolitre parazit kültürü ortamı ekleyin ve plakayı ışıktan koruyarak oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin.

İnkübasyonun sonunda, her bir oyuğa 170 mikrolitre parazit kültürü ortamı ekleyin ve enfekte olmuş eritrositleri santrifüjleme ile plakanın dibine çökeltin. Plakayı bir atık kabına iterek süpernatanı çıkarın ve etidyum bromür etiketli enfekte eritrositleri, az önce gösterildiği gibi, kuyu başına 200 mikrolitre parazit kültürü ortamı ile iki kez daha yıkayın.

İkinci yıkamadan sonra, peletleri rahatsız etmeden her bir kuyucuktan tüm süpernatan hacmini dikkatlice çıkarmak için çok kanallı bir pipet kullanın ve etidyum bromür etiketli enfekte eritrositleri, daha önce parazit kültürü ortamında hazırlanan uygun kontroller ve test numuneleri dahil olmak üzere 30 mikrolitre antikor çözeltisi içinde yeniden süspanse edin. Ardından, plakayı ışıktan koruyarak 45 dakika boyunca 37 santigrat dereceye yerleştirin.

Enfekte eritrositler opsonize edilirken, THP-1 hücrelerini santrifüjleme ile toplayın ve peleti 12 mililitre taze önceden ısıtılmış THP-1 hücre kültürü ortamında yeniden süspanse edin.

İkinci bir santrifüjlemeden sonra, peleti saymak için 1 mililitre THP-1 hücre kültürü ortamında yeniden süspanse edin ve hücre konsantrasyonunu THP-1 hücre kültürü ortamında mililitre başına 5 kez 10 ila 5. hücrelere ayarlayın. Engelleme çözeltisini ikinci 96 oyuklu plakadan çıkarın ve her oyuğa 100 mikrolitre THP-1 hücresi ekleyin. Ardından, plakayı hücre kültürü inkübatörüne yerleştirin.

Opsonizasyon inkübasyonunun sonunda, opsonizasyon plakasının her bir oyuğuna 170 mikrolitre parazit kültürü ortamı ekleyin ve enfekte eritrositleri santrifüjleme ile plakanın dibine çökeltin. Opsonize, enfekte eritrositleri, ikinci yıkamadan sonra süpernatanı dikkatlice çıkarmak için çok kanallı bir pipet kullanarak kuyu başına 200 mikrolitre parazit kültürü ortamı ile iki kez yıkayın.

Opsonize, enfekte eritrositleri oyuk başına 100 mikrolitre önceden ısıtılmış THP-1 hücre kültürü ortamında yeniden süspanse edin ve her opsonize, enfekte eritrosit süspansiyonunun 50 mikrolitresini fagositoz plakasındaki karşılık gelen bir kuyucuğa aktarın. Tüm hücreler eklendiğinde, plakayı ışıktan koruyarak en fazla 40 dakika hücre kültürü inkübatörüne yerleştirin.

Kuluçka süresinin sonunda, 4 santigrat derecede santrifüjleme ile fagositozu durdurun. Süpernatanı çıkarın ve peletleri oyuk başına 150 mikrolitre oda sıcaklığında amonyum klorür parçalama çözeltisi ile yeniden süspanse edin. Tam olarak üç dakika sonra, lizizi durdurmak için PBS'ye 100 mikrolitre buz gibi% 2 FBS ekleyin ve sağlam hücreleri santrifüjleme ile çökeltin.

Daha sonra, hücreleri yıkama başına kuyu başına PBS'de 200 mikrolitre taze buz gibi% 2 FBS ile üç kez yıkayın. Son yıkamadan sonra, hücre peletini oyuk başına PBS'de 200 mikrolitre taze buz gibi% 2 FBS'de yeniden süspanse edin.

Akış sitometrisi edinimi ve analizi için, hücreleri hemen bir akış sitometresine yükleyin ve THP-1 hücrelerini geçit etmek için enfekte eritrositleri olmayan kuyular için doğrusal ileri ve doğrusal yan saçılma grafiğini kullanın. Bu kapıda 10.000 olay elde edin ve etidyum bromür floresan yoğunluğunu ölçmek için bir histogram grafiği oluşturmak için pozitif bir kontrol ile opsonize edilmiş enfekte eritrositlerle THP-1 hücrelerini kullanın.

Analiz için, enfekte eritrositleri olmayan kuyucuklar için doğrusal ileri ve doğrusal yan saçılma grafiğini açın ve THP-1 hücrelerini kapılayın. Ardından, bir FL3 histogramında pozitif bir kapı ayarlayın ve etidyum bromür pozitif THP-1 hücrelerinin yüzdesini belirlemek için bu kapıları diğer tüm numune kuyucuklarına kopyalayın.