Tam Kan Kullanılarak Hızlı Nötrofil Kemotaksisi Analizi için Mikroakışkan Çip Tabanlı Bir Yöntem

Bir tam kan örneğine, nötrofiller hariç kan hücrelerine yönelik spesifik antikor kompleksleri ekleyin.

Antikor kompleksine bağlı kan hücrelerine bağlanan manyetik parçacıklar ekleyin.

İmmünolojik olarak etiketlenmiş numuneyi bir mikroakışkan çipin hücre yükleme portuna aktarın.

Manyetik diskleri hücre yükleme portuna takın.

Manyetik alan, immünmömanyetik olarak etiketlenmiş hücreleri çeker ve onları portun yan duvarlarına hapseder.

Etiketlenmemiş olan nötrofiller çipin içine akar ve hücre yerleştirme alanında sıkışıp kalır.

Belirlenen rezervuarlara floresan etiketli kemoatraktan çözeltisi ve migrasyon ortamı ekleyin. Sıvılar mikroakışkan kanallardan akar ve bir konsantrasyon gradyanı oluşturur.

Kemoatraktan nötrofil reseptörüne bağlandığında, hücre içi değişiklikleri tetikleyerek nötrofillerin hücre iskeletlerini yeniden düzenlemesine ve psödopodları uzatmasına neden olur.

Bu psödopodlar, nötrofilleri daha yüksek kemoatraktan konsantrasyonlarına doğru iten ayaklar gibi davranır - kemotaksis adı verilen bir süreç.

Kemoatraktan gradyanına yanıt olarak nötrofil göçünü izlemek için uygun mikroskopi tekniklerini kullanın.

Deiyonize suyu cihazdan çıkarın ve çıkıştan 100 mikrolitre Fibronektin çözeltisi ekleyin. Tüm kanalların Fibronektin solüsyonu ile doldurulduğundan emin olmak için üç dakika bekleyin. Ardından, cihazı kapalı bir Petri kabında oda sıcaklığında bir saat inkübe edin.

Daha sonra, Fibronektin çözeltisini cihazdan çıkarın ve çıkıştan 100 mikrolitre migrasyon ortamı ekleyin. Yine, tüm kanalların geçiş ortamıyla doldurulduğundan emin olmak için üç dakika bekleyin. Cihazı kemotaksis deneyinde kullanmadan önce cihazı oda sıcaklığında bir saat daha inkübe edin. 10 mikrolitre tam kanı 1,5 mililitrelik bir tüpe koyun. Daha sonra, bir nötrofil izolasyon kitinden iki mikrolitre manyetik parçacık içine 2 mikrolitre antikor kokteyli ekleyin ve antikor etiketli hücreleri manyetik olarak etiketlemek için tüpü hafifçe karıştırın. Etiket karışımını oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin.

Ardından, cihazın hücre yükleme portunun iki tarafına iki küçük manyetik disk takın. Ortamı cihazın tüm bağlantı noktalarından aspire edin. Ardından, etiketli kan karışımından iki mikrolitreyi hücre yükleme portundan mikroakışkan cihaza yavaşça pipetleyin. Mikroakışkan cihazı 37 santigrat derecede sıcaklık kontrollü mikroskop aşamasına yerleştirin. Hücre yerleştirme alanında yeterli nötrofil sıkışana kadar birkaç dakika bekleyin.

Daha sonra, iki pipetleyici kullanarak 100 mikrolitre migrasyon ortamında 100 mikrolitre kemoatraktan solüsyonu belirlenen giriş rezervuarlarına ekleyin. Bu, sürekli laminer akış bazlı kimyasal karıştırma ile bir kemoatraktan gradyan oluşturacaktır. Kemoatraktan, FMLP gibi rekombinant proteinler veya KOAH'lı hastalardan alınan balgam süpernatanı gibi klinik örnekler olabilir.

Akış stabilize olduktan sonra, kanaldaki FITC dekstran gradyanının floresan görüntülerini elde edin. Daha sonra, cihazı sıcaklık kontrollü mikroskop aşamasında veya geleneksel bir hücre kültürü inkübatöründe 15 dakika inkübe edin. İnkübasyonun ardından, veri analizi için hücrenin son konumlarını kaydetmek için 10 kez hedef kullanarak gradyan kanalını görüntüleyin.